一种烟草基因编辑素材中多酚类物质的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种烟草基因编辑素材中多酚类物质的测定方法，使用以下装置：样品萃取瓶，包括：外套管(1)、内套管(2)、导液管(4)、筛板；样品萃取架(5)；样品收集架(6)；转抽(7)和下压板(8)。步骤为：①萃取烟草粉末；②过滤；③收集样品滤液；④使用高效液相色谱法进行测定。本发明专利技术的测定方法可用于检测烟草基因编辑素材中多酚类物质的含量，具有前处理简单方便、定量准确、重复性好的优点。

A method for determination of polyphenols in tobacco gene editing material

The invention discloses a method for determining polyphenols in tobacco gene editing material, which uses the following devices: sample extraction bottle, including outer casing (1), inner casing (2), liquid conduction tube (4), sieve plate; sample extraction rack (5); sample collection rack (6); trans-extraction (7) and lower pressure plate (8). The steps are: extraction of tobacco powder; filtration; collection of sample filtrate; and determination by high performance liquid chromatography. The determination method of the invention can be used for detecting the content of polyphenols in tobacco gene editing material, and has the advantages of simple and convenient pretreatment, accurate quantification and good repeatability.

【技术实现步骤摘要】
一种烟草基因编辑素材中多酚类物质的测定方法
本专利技术属于分析化学
，具体涉及一种烟草基因编辑素材中多酚类物质的测定方法。
技术介绍
多酚类物质是烟草中重要次生代谢产物，烟草中的多酚主要包含咖啡单宁，香豆素，黄酮，等结构类型，主要化合物包括绿原酸、莨菪葶、芦丁。它们对于烟草及烟叶的生长发育发挥着重要作用。研究结果表明：一方面，多酚也是影响烟草品质的重要成分，对烟叶色泽、烟气香吃味和烟气生理强度等方面起着重要作用。另一方面，多酚是卷烟烟气中简单酚的重要前体化合物，对卷烟烟气有害成分释放量有显著影响。因此准确烟草中的多酚类化合物对烟草质量评价和卷烟降焦减害均具有重要意义。目前，烟草中的多酚测定已有较多研究报道，方法涉及分光光度法、气相色谱法(GC)或(GCMS)、高效液相色谱法、化学发光检测法、毛细管电泳(CE)检测法等。其中高效液相色谱法是最常用的方法，目前的烟草行业标准YC/T202-2006采用高效液相色谱法测定多酚。但色谱分析时间长，每个样品分析周期长，每个样品需要40min以上。随着烟草行业烟草基因编辑工厂化育种工作的启动，通过基因编辑将产生数万个素材。要对这些海量的素材进行快速化学分析评价评价，现有标准方法很难满足需求。因此，亟待专利技术一种能快速处理海量基因编辑素材中多酚类物质的高通量检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种测定烟草基因编辑素材中多酚类物质的方法，为海量筛选评价提供方法依托和高通量处理技术。本专利技术的目的还在于提供一种集提取、固相萃取净化、过滤和滤液收集为一体的前处理装置，可有效实现烟草基因编辑素材中多酚类物质的高通量分析测定。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的。一种烟草基因编辑素材中多酚类物质的测定方法，使用以下装置：样品萃取瓶，包括：外套管1，其底部密封且为平底，其口部有一密封圈11；内套管2，其外径与所述外套管1的内径相适配，其的长度大于所述外套管1的长度；导液管4，位于所述内套管2内，其下端有一扩张口与所述内套管2的下端内壁密封固定连接，其与所述内套管2上端口固定连接形成受压面21，其上部伸出所述内套管2外部，并回弯向下；筛板3，位于所述内套管2的下端开口内，为一个或多个；样品萃取架5，其内有若干样品萃取瓶放置孔51，用于放置所述样品萃取瓶；样品收集架6，其内有若干样品瓶放置孔61和若干废液收集瓶放置孔62，用于放置样品瓶610和废液收集瓶620；转抽7，位于所述样品收集架6中心部；所述样品收集架6和所述样品萃取架5可分别围绕所述转抽7旋转；下压板8，其表面伸出有若干下压头81；该方法包括以下步骤：①烟草样品粉碎，过40目筛；准确称取0.25g(精确至0.1mg)的烟草粉末样品于外套管中，加入25mL的萃取剂，插入内套管并放置在所述样品萃取架5上进行超声萃取35min；②利用转轴进行固定，使所述导液管的管口对准废液收集瓶620，下压内套管的受压面21并使萃取溶液通过过滤筛板(3)过滤后进入导液管中，并从中流出，最初滤液2-3mL进入废液收集瓶620中；③以转轴为中心，转动样品萃取架，使所述导液管的向下回弯管口对准所述样品瓶610瓶口，继续下压内套管的受压面21，将1-1.5mL样品滤液转移到样品瓶610中，冷却至室温得到待分析的样品滤液；④使用高效液相色谱分析进行测定，采用峰面积法进行定量，对比样品烟草基因编辑素材中多酚类物质的的峰面积与标准溶液工作曲线的峰面积法，即可确烟草基因编辑素材中多酚类物质的含量。根据样品中多酚类物质的含量进行对比，结合基因编辑位点，考察烟草基因功能对代谢物的影响规律。优选地，所测定的多酚类物质为：5-O-咖啡酰奎宁酸，绿原酸，4-O-咖啡酰奎尼酸，咖啡酸，东莨菪素，芦丁，山柰酚-3-芸香糖甙，槲皮素。优选地，步骤①所述的萃取试剂为80v/v％的甲醇水溶液。优选地，步骤②所述得到筛板3的孔径为0.45μm；所述筛板3为两块，两块筛板之间填充有固相萃取填料。优选地，所述固相萃取填料的粒径30-50μm，装填量为0.5g。优选地，步骤④所述的高效液相色谱为：色谱柱：EclipseXDB-C18RRLC柱(50×4.6mm，1.8μm)；流速：2.0mL/min；柱温：30℃，进样量：5.0μL；流动相：A为0.1v/v％甲酸水溶液；B为色谱纯乙腈水溶液，梯度洗脱；检测时间：6min；检测波长：345nm。优选地，所述梯度洗脱条件为：0-4.5min，10v/v％乙腈水溶液递增到80v/v％，保留0.5min；5.5-6.0min，恢复到初始条件10v/v％乙腈水溶液。本专利技术的方法使用的样品萃取瓶集萃取、过滤、转移为一体，样品在外套管1中萃取结束后；在受压面21处用力下压内套管2，萃取液通过筛板3过滤后进入到导液管4中，并从导液管4的回弯向下口流出进入样品瓶中，得到样品滤液并进行色谱分析。此过程样品的萃取、过滤、转移为一体，避免了操作所带来的实验误差。外套管1口部装有一个密封圈11，用于萃取时固定内套管2，以防止萃取液溅出以及样品过滤时缓冲。在本专利技术中，导液管4直径优选为1-2mm。使用本专利技术装置的多个样品萃取瓶操作过程如下：把若干样品萃取瓶(如八个)放入样品萃取架5的萃取瓶放置孔51中，分别放入样品进行萃取操作；开始收集的部分溶液(如2ml)丢弃，因此开始先分别把导液管4的向下回弯对准样品收集架6上的废液收集瓶620的口部，把下压板8盖上，使下压头81分别对准受压面21，废液收集瓶620里的液体达到要求后，旋转样品萃取架5或样品收集架6，使导液管4的向下回弯对准样品瓶610的口部，继续向下压下压板8，八个样品萃取瓶中的液体样品分别通过各自的筛板3过滤后进入各自的导液管4中，再进入样品瓶610中，继续下压所述下压板8使内套管2下压到外套管1的底部，则所有样品萃取瓶中的液体通过各自的导液管4分别都转移到样品瓶610中，完成样品转移操作。样品瓶610中的样品可分别用于分析。本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术使用的装置集提取、固相萃取净化、过滤、滤液收集为一体，样品的前处理过程中不需要转移样品就可以直接萃取、过滤并收集得到待分析样品，有效避免了操作所带来的实验误差。提供了一种测定烟草基因编辑素材中多酚类物质的高通量分析方法，适用于大批量样品的准确测试；简单、方便、萃取效果好、样品处理通量高、定量准确、重复性好、检出限低等优点。(2)本专利技术的测定方法样品萃取效果和精密度均比传统方法有较大提高，分析结果与标准方法测定的结果相符合。具有定量准确、重复性好、检出限低等优点，适用于大批量样品的准确测试。该测定方法样品分析效率比传统方法有较大提高，可为烟草基因编辑素材中多酚类物质的检测提供准确可靠的方法，海量筛选和评价以及烟草基因功能探索研究提供有效的技术支持。附图说明图1为本专利技术的外套管示意图；图2为本专利技术的内套管示意图；图3为本专利技术的萃取混合时内套管插入外套管口部示意图；图4为本专利技术的萃取液过滤、转移时内套管插入外套管内部示意图；图5为本专利技术的样品萃取架和样品收集架示意图；图6为本专利技术的一个样品萃取瓶放置在样品萃取架上和样品收集瓶放置在样品收集架上时样品转移步骤的示意图；图7为本专利技术的透明下压板示意图；图8为多酚类物质标准本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草基因编辑素材中多酚类物质的测定方法，其特征在于，使用以下装置：样品萃取瓶，包括：外套管(1)，其底部密封且为平底，其口部有一密封圈(11)；内套管(2)，其外径与所述外套管(1)的内径相适配，其的长度大于所述外套管(1)的长度；导液管(4)，位于所述内套管(2)内，其下端有一扩张口与所述内套管(2)的下端内壁密封固定连接，其与所述内套管(2)上端口固定连接形成受压面(21)，其上部伸出所述内套管(2)外部，并回弯向下；筛板(3)，位于所述内套管(2)的下端开口内，为一个或多个；样品萃取架(5)，其内有若干样品萃取瓶放置孔(51)，用于放置所述样品萃取瓶；样品收集架(6)，其内有若干样品瓶放置孔(61)和若干废液收集瓶放置孔(62)，用于放置样品瓶(610)和废液收集瓶(620)；转抽(7)，位于所述样品收集架(6)中心部；所述样品收集架(6)和所述样品萃取架(5)可分别围绕所述转抽(7)旋转；下压板(8)，其表面伸出有若干下压头(81)；该方法包括以下步骤：①准确称取0.25g的烟草粉末样品于外套管中，加入25mL的萃取剂，插入内套管并放置在所述样品萃取架(5)上进行超声萃取35min；②利用转轴进行固定，使所述导液管的管口对准废液收集瓶(620)，下压内套管的受压面(21)并使萃取溶液通过过滤筛板(3)过滤后进入导液管中，并从中流出的最初滤液2‑3mL进入废液收集瓶(620)中；③以转轴为中心，转动样品萃取架，使所述导液管的向下回弯管口对准所述样品瓶(610)瓶口，继续下压内套管的受压面(21)，将1‑1.5mL样品滤液转移到样品瓶(610)中，冷却至室温得到待分析的样品滤液；④使用高效液相色谱分析进行测定，采用峰面积法进行定量，对比样品烟草基因编辑素材中多酚类物质的的峰面积和标准溶液工作曲线，即可确烟草基因编辑素材中多酚类物质的含量。...

【技术特征摘要】
1.一种烟草基因编辑素材中多酚类物质的测定方法，其特征在于，使用以下装置：样品萃取瓶，包括：外套管(1)，其底部密封且为平底，其口部有一密封圈(11)；内套管(2)，其外径与所述外套管(1)的内径相适配，其的长度大于所述外套管(1)的长度；导液管(4)，位于所述内套管(2)内，其下端有一扩张口与所述内套管(2)的下端内壁密封固定连接，其与所述内套管(2)上端口固定连接形成受压面(21)，其上部伸出所述内套管(2)外部，并回弯向下；筛板(3)，位于所述内套管(2)的下端开口内，为一个或多个；样品萃取架(5)，其内有若干样品萃取瓶放置孔(51)，用于放置所述样品萃取瓶；样品收集架(6)，其内有若干样品瓶放置孔(61)和若干废液收集瓶放置孔(62)，用于放置样品瓶(610)和废液收集瓶(620)；转抽(7)，位于所述样品收集架(6)中心部；所述样品收集架(6)和所述样品萃取架(5)可分别围绕所述转抽(7)旋转；下压板(8)，其表面伸出有若干下压头(81)；该方法包括以下步骤：①准确称取0.25g的烟草粉末样品于外套管中，加入25mL的萃取剂，插入内套管并放置在所述样品萃取架(5)上进行超声萃取35min；②利用转轴进行固定，使所述导液管的管口对准废液收集瓶(620)，下压内套管的受压面(21)并使萃取溶液通过过滤筛板(3)过滤后进入导液管中，并从中流出的最初滤液2-3mL进入废液收集瓶(620)中；③以转轴为中心，转动样品萃取架，使所述导液管的向下回弯管口对准所述样品瓶(610)瓶口...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雪梅，李晶，王晋，黄海涛，刘欣，许永，孔维松，杨光宇，张涛，曾婉俐，向海英，许力，蒋佳芮，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53