一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法技术

本发明专利技术公开了一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法，其包括如下步骤：(1)混合对照品溶液的制备：称取钩藤碱和异钩藤碱适量，精密称定，加甲醇配制成钩藤碱和异钩藤碱的混合对照溶液；(2)供试品溶液的制备：准确称取小儿七星茶颗粒，加入热水溶解，超声处理，放冷，用氨水调节pH值，再用乙酸乙酯振摇提取，回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇溶解，即可；(3)高效液相色谱法测定：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：乙腈(A):0.02‑0.07％二乙胺‑(7‑10)mM醋酸铵(B)＝40‑60:60‑40V/V；流速：0.8‑1.2mL/min；洗脱时间：35‑60分钟；柱温：25‑35℃；检测波长：240‑250nm；该含量测定方法操作简单、准确反映产品的真实含量，适合产业化日常生产检验。

【技术实现步骤摘要】
一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法
本专利技术涉及一种中药的检测方法，尤其是涉及小儿七星茶颗粒的质量控制方法。
技术介绍
小儿七星茶颗粒作为民间传统的小儿消滞凉茶，其主要功能为开胃消滞、清热定惊，用于小儿积滞化热、消化不良、不思饮食、烦躁易惊、夜寐不安、大便不畅、小便短赤。本品种被收录于2015年版《中国药典》一部，标准中的鉴别项下对山楂和甘草进行鉴定；含量测定项下对甘草酸进行含量测定，并不能全面评价本品种的质量，标准有待进行提高。其中，钩藤具有清热镇惊、平肝熄风功能，是本品起定惊作用的主药。钩藤碱和异钩藤碱是钩藤的主要生物碱之一，二者占钩藤总碱的40％以上，主要作用于心血管系统和中枢神经系统，具有降低血压、扩张血管、减慢心率和抑制心肌收缩力等生物效应。因此评价钩藤及其制剂质量多以钩藤总生物碱或钩藤碱含量为指标。在钩藤的质量控制方面，中国药典对钩藤的药材性状、异钩藤碱的薄层色谱鉴别作相关规定，尚未收录钩藤碱的TLC薄层鉴别，也没有钩藤生物碱的含量测定项。由于药品成分复杂，关于小儿七星茶颗粒中钩藤生物碱的检测方法极少，已报道的方法主要测定钩藤碱含量，且灵敏度低、分离度差，尚未有同时测定钩藤碱和异钩藤碱的方法报道，无法全面评价成份中钩藤的质量，较难应用于小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱的检测。综上所述，采用HPLC色谱分离技术对小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱同时进行准确的定量测定，能提高对小儿七星茶颗粒产品质量的全面评价，对产品的质量管控具有重要的意义。
技术实现思路
鉴于上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种高效液相测定小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量的方法。该含量测定方法操作简单、准确反映产品的真实含量，适合产业化日常生产检验。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法，其包括如下步骤：(1)混合对照品溶液的制备：称取钩藤碱和异钩藤碱适量，精密称定，加甲醇配制成钩藤碱和异钩藤碱的混合对照溶液；(2)供试品溶液的制备：准确称取小儿七星茶颗粒，加入热水溶解，超声处理，放冷，用氨水调节pH值，再用乙酸乙酯振摇提取，回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇溶解，即可；(3)高效液相色谱法测定：色谱条件为：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：乙腈(A):(0.02-0.07)％二乙胺-(7-10)mM醋酸铵(B)＝40-60:60-40V/V；流速：0.8-1.2mL/min；洗脱时间：35-60分钟；柱温：25-35℃；检测波长：240-250nm；测定法：分别将步骤(1)的混合对照品溶液和步骤(2)的供试品溶液进行高效液相色谱测定。进一步优选，本专利技术步骤(2)供试品溶液的制备：准确称取小儿七星茶颗粒，置于具塞椎形瓶中，加入3-5倍量(g/ml)60-80℃热水使溶解，超声处理30-90min，放冷，用氨水调节pH值至9-10，再用3-5倍量(g/ml)乙酸乙酯振摇提取1-3次，合并回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇使溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。进一步优选，步骤(2)供试品溶液的制备：准确称取小儿七星茶颗粒，置于具塞椎形瓶中，加入3.6倍量60℃热水使溶解，超声处理60min，放冷，用氨水调节pH值至9-10，再用3.6倍量乙酸乙酯振摇提取2次，合并回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇1mL使溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。本专利技术所述的步骤(3)进一步优选流动相为乙腈(A):(0.02-0.05)％二乙胺-(7-9)mM醋酸铵(B)＝40-60:60-40V/V。最佳流动相：乙腈(A):0.05％二乙胺-9mM醋酸铵(B)，梯度洗脱如表1表1梯度洗脱时间A相B相0-26min42％58％26-31min60％40％31-38min60％40％38-43min42％58％流速：1mL/min；柱温：30℃；检测器：DAD，检测波长为247nm。色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶的碱性柱，优选ZorbaxExtendC18柱。本品每1g以钩藤碱和异钩藤碱总和计，不得少于6.0μg。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：中药组方成份复杂，提取富集目标成份，使用合适的色谱条件进行分析是两个难点。一、本研究通过考察比较不同溶剂的提取率，找到了适用于钩藤生物碱的萃取溶液。供试品的制备：1、本专利技术所选择60℃-80℃热水，能够加速有效成分在颗粒中的溶出，尤其是60℃效果最明显。钩藤药材溶液中生物碱在60～80℃长时间加热条件下稳定性较差，钩藤碱、异钩藤碱相互转化。本专利技术人发现钩藤碱、异钩藤碱超声提取时间短，则提取不完全，若低于30分钟，超声加样回收率过低；超过90分钟，钩藤碱、异钩藤碱不稳定。因此，只有在本专利技术的超声提取范围内，才能将钩藤中钩藤碱与异钩藤碱完全提取出来且提取物放置24h均稳定，超声加样回收率合格。2、钩藤碱、异钩藤碱易溶解于氨水中，但是氨水在超声提取中的添加过程是非常重要的。氨水挥发性强，超声过程发热使氨水挥发导致pH不稳定，影响目标成份的萃取效率及准确率。因此氨水必须在超声之后冷置室温后才能加入。3、考察多种萃取溶剂如甲醇、乙醚、氯仿和乙酸乙酯的提取率。结果表明，乙酸乙酯的提取率明显高于其他几种溶剂，因此选择乙酸乙酯作为提取剂。详细见实验例部分。二、由于成份复杂，色谱条件使用的有机相、pH调节剂、梯度等都会影响色谱分析效果。通过对不同有机相、pH调节剂以及梯度等进行了考察，最终得到适用于小儿七星茶中钩藤生物碱成分的分析测定。与现有报道的小儿七星茶中钩藤生物碱测定方法相比，分离效果有明显提高。1、现有技术公开流动相有甲醇-三乙胺-冰醋酸调PH5-7、氨水、磷酸等，本专利技术筛选流动相时发现三乙胺碱性强，液相基线很难跑平。并且由于三乙胺在柱子的高残留性，对柱子寿命影响较大。二乙胺残留性相对没有那么强，作为离子抑制剂，对生物碱拖尾改善很明显。综合考虑采用二乙胺代替三乙胺。2、经研究，小儿七星茶颗粒在液相条件中使用磷酸时，导致目标成份的出峰时间过早，受干扰峰影响较多，不利于分离与分析目标成份。另外，不用磷酸还考虑到磷酸为非挥发性酸，残留性也较强，对柱子伤害会比较大。3、氨水挥发性强，使用氨水的条件稳定性没有醋酸铵的稳定性好。对液相条件的重复度有影响。而使用醋酸铵时的出峰时间适中，不受干扰峰影响。4、本专利技术液相条件的pH约为8，在普通色谱柱的pH范围(1-8)的上限。为了保护液相色谱柱，本专利技术根据色谱流动相条件选择有针对的碱性柱，如使用ZorbaxExtendC18(2-11.5)类似的耐碱柱。三、本专利技术采用反相高效液相色谱法同时测定小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱的含量，钩藤碱含量的定量限(S/N＝10)为0.012μg/mL，平均回收率为80％-115％，相对标准偏差小于6％；异钩藤碱含量的定量限(S/N＝10)为0.007μg/mL，平均回收率为80％-115％，相对标准偏差小于6％。采用本专利技术的方法同时检测小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱的含量，前处理简单，分离度好且准确度高，能适用于小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量的准确测定，也非常适合小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱的批量检测；为小儿七星茶颗粒产品质量控本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法，其包括如下步骤：(1)混合对照品溶液的制备：称取钩藤碱和异钩藤碱适量，精密称定，加甲醇配制成钩藤碱和异钩藤碱的混合对照溶液；(2)供试品溶液的制备：准确称取小儿七星茶颗粒，加入热水溶解，超声处理，放冷，用氨水调节pH值，再用乙酸乙酯振摇提取，回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇溶解，即可；(3)高效液相色谱法测定：色谱条件为：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：乙腈(A):(0.02％‑0.07％)二乙胺‑(7‑10)mM醋酸铵(B)＝40‑60:60‑40V/V；流速：0.8‑1.2mL/min；洗脱时间：35‑60分钟；柱温：25‑35℃；检测波长：240‑250nm；测定法：分别将步骤(1)的混合对照品溶液和步骤(2)的供试品溶液进行高效液相色谱测定。

【技术特征摘要】
1.一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法，其包括如下步骤：(1)混合对照品溶液的制备：称取钩藤碱和异钩藤碱适量，精密称定，加甲醇配制成钩藤碱和异钩藤碱的混合对照溶液；(2)供试品溶液的制备：准确称取小儿七星茶颗粒，加入热水溶解，超声处理，放冷，用氨水调节pH值，再用乙酸乙酯振摇提取，回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇溶解，即可；(3)高效液相色谱法测定：色谱条件为：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：乙腈(A):(0.02％-0.07％)二乙胺-(7-10)mM醋酸铵(B)＝40-60:60-40V/V；流速：0.8-1.2mL/min；洗脱时间：35-60分钟；柱温：25-35℃；检测波长：240-250nm；测定法：分别将步骤(1)的混合对照品溶液和步骤(2)的供试品溶液进行高效液相色谱测定。2.如权利要求1所述的含量方法，其特征在于，所述步骤(2)供试品溶液的制备：准确称取小儿七星茶颗粒，置于具塞椎形瓶中，加入3-5倍量60-80℃热水使溶解，超声处理30-90min，放冷，用氨水调节pH值至9-10，再用3-5倍量乙酸乙酯振摇提取1-3次，合并回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇使溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。3.如权利要求2所述的含量测定方法，其特征在于，所述步骤(2)供试品溶液的制备：准确称取小儿七星茶颗粒，置于具塞椎形瓶中，加入3.6倍量60℃热水使溶解，超声处理60min，放冷，用氨水调节pH值至9-10，再用3.6倍量乙酸乙酯振摇提取2次，合并回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇1mL使溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。4.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中流动相为：乙腈(A):(0.02％-0.05％)二乙胺-(7-9mM)醋酸铵(B)＝40-60:60-40V/V。5.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中流动相梯度洗脱，6.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中色谱条件为：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的...

【专利技术属性】
技术研发人员：方广宏，郑荣波，黄晓丹，吴悦，和海龙，林德晖，
申请(专利权)人：广州王老吉药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44