透明质酸高通量微量快速检测方法技术

透明质酸(HA)是一种由糖醛酸和葡糖胺为双糖结构的大型多糖，其自然产品和合成产品已广泛应用于临床治疗、制药、生物材料以及化妆品行业。研究发现，体内组织液中HA的浓度变化与一些病理生理状态相关，例如：类风湿、肝病和某些肿瘤患者组织液HA有显著变化。本发明专利技术用96孔板进行化学呈色反应，红紫色反应产物在530nm处有最大吸收，可用酶标仪检测，反应产物的呈色深浅及其OD值和HA浓度相关。本发明专利技术建立了HA浓度与OD值的标准曲线，并用其计算生物样品中HA的含量。本发明专利技术的特点是所需样品微量(10‑20μL)、样本数大、耗材少耗时短易操作。本发明专利技术适用于药品、生物材料和化妆品中HA含量测定，也可用于人、大鼠等的组织液或细胞液中HA浓度的体外快速测定。

High throughput and rapid detection of hyaluronic acid

Hyaluronic acid (HA) is a large polysaccharide composed of glucuronic acid and glucosamine. Its natural products and synthetic products have been widely used in clinical treatment, pharmaceuticals, biomaterials and cosmetics industry. Studies have found that changes in the concentration of HA in tissue fluids are associated with some pathophysiological conditions, such as rheumatoid, liver disease and some tumor patients with significant changes in tissue fluids HA. The method uses 96-hole plate for chemical coloration reaction. The product of red-purple reaction has maximum absorption at 530 nm and can be detected by enzyme labeling instrument. The color depth of the reaction product is related to its OD value and HA concentration. The standard curve of HA concentration and OD value is established and used to calculate the content of HA in biological samples. The characteristics of the invention are that the required sample is 10 (20 L), the sample size is large, the material consumption is small, the time is short and the operation is easy. The method is suitable for the determination of HA content in medicines, biological materials and cosmetics, and can also be used for the rapid determination of HA concentration in tissue fluid or cell fluid of human, rat, etc.

【技术实现步骤摘要】
透明质酸高通量微量快速检测方法
本专利技术涉及到一种透明质酸的高通量微量快速检测方法。
技术介绍
透明质酸(hyaluronicacid,HA)是一种由糖醛酸和葡糖胺为双糖结构组成的大型多糖物质，其自然产品和合成产品已经广泛应用于临床治疗、制药、生物材料(眼科手术辅助剂、预防腹腔粘连、治疗关节疾病等)以及化妆品(保湿、防皱)行业。研究发现体内组织和体液中HA的浓度变化与一些特定的病理生理状态相关，例如：类风湿性关节炎、肝病、某些肿瘤患者组织液样品中HA含量均有显著变化。尤其是在肝硬化诊断方面，HA含量测定明显优于所有常规肝功能试验，这也是判断肝纤维化的定量指标。现有的HA测定方法为免疫分析方法和生化方法。免疫分析方法是使用抗HA抗体的检测方法，包括放射免疫法、酶联免疫法和免疫荧光法等，这类方法耗时耗材，且存在放射性辐射和生物污染等问题。特异性HA酶消化法、HPLC法等生化方法需要进行酶解处理，不适合用于大批量样品的HA含量测定。目前企业普遍使用的方法大都为生化法，依照《中华人民共和国医药行业标准YY0308-透明质酸钠含量测定》，采用Bitter的咔唑显色紫外分光光度计比色法，该方法前处理和测定时间都较长，用比色皿单个测定、样品使用量大且效率低。本专利申请的方法建立了一种微量、快速、安全的HA高通量检测方法，无论是对化妆品行业和制药行业以及生物材料行业、还是对实验室及医院临床的HA快速检测都有着重要意义。本专利技术的原理：HA水解后产生的葡萄糖醛酸与咔唑试剂作用产生红紫色，并在530nm处有最大吸收，可以用酶标仪检测。呈色的深浅与葡萄糖醛酸含量成正比，OD值和HA浓度相关。本专利技术的应用：通过制定HA标准浓度和相关吸光度(OD值)的标准曲线，并用此标准曲线计算生物样品HA含量。本专利技术的特点：样品微量(10-20μL)，样板数量大(96孔板)，检测耗时短，易操作。
技术实现思路
1.
技术实现思路
简述：首先制备HA溶液，采用梯度稀释法配制系列标准液。分别取20μL各系列浓度的标准液于微孔(96孔板)中，置于冰上；缓慢加100μL0.025M四硼酸钠硫酸溶液于各孔中混匀；95℃水浴15min后置于冰上将反应物迅速冷却；各孔再加4μL0.125％咔唑乙醇溶液，混匀，95℃水浴15min后，冷却至室温。用酶标仪(96孔板设定)在530nm处直接测定96孔板微孔中的吸光度。和传统法比较，本方法所需样品量减少了50-100倍，紫外分光光度计的传统方法只可以每个样品分别检测，样品数低且效率低。而酶标仪的使用让检测样品的数量得以提升且效率提高。2.专利技术技术方案2.1HA标准品准备称取适量医用级HA，加入双蒸水稀释，配制成10mg/mL；2.2制备HA标准液系列(梯度稀释法)制备HA浓度为0，0.078，0.156，0.312，0.625，1.25，2.50，5.00，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100，200，400，800，1600，3200，6400μg/mL系列标准液(注意：传统法《中华人民共和国医药行业标准YY0308-透明质酸钠含量测定》中标准液使用葡萄糖醛酸，其系列浓度为0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0μg/mL)。2.3微孔(96孔板)快速反应酶标仪检测，即高通量法的建立并和传统法比较a.传统法对照：15mL试管反应产物/紫外分光光度法检测(传统法)参照传统法《中华人民共和国医药行业标准YY0308-透明质酸钠含量测定》中所述方法用试管进行实验，分别取1mL各标准液于各试管，标记，置于冰水浴中，各管缓慢加5mL0.025M四硼酸钠硫酸溶液，摇匀，95℃水浴15min后冰水浴迅速冷却，各管加0.2mL0.125％咔唑乙醇溶液，摇匀后95℃水浴15min，冷却至室温。以浓度为0的试管作对照，用紫外分光光度计和比色皿(3mL)测定530nm处的OD值，每测一个浓度都需要更换比色皿。b.半传统法对照：15mL试管反应产物/酶标仪检测分别取100μL上述在试管中反应的液体，置于微孔(96孔板)中，用酶标仪测定530nm处的OD值。c.微量高通量法(本专利)：微孔(96孔板)反应产物/酶标仪检测(高通量法)96孔板，分别取20μL各系列浓度的标准液于微孔中，置于冰上；缓慢加100μL0.025M四硼酸钠硫酸溶液于各孔中混匀；95℃水浴15min后置于冰上将反应物迅速冷却；各孔再加4μL0.125％咔唑乙醇溶液混匀，95℃水浴15min后，冷却至室温。用酶标仪在530nm处测定OD值，并以标准HA浓度(横坐标)对相应的OD值(纵坐标)作标准曲线。检测样品则按标准曲线给出的公式计算样品HA浓度。2.4HA微量高通量法的灵敏度和重复性测试重复9次以上HA系列标准浓度微量反应和吸光度的酶标仪检测，使用分析软件GraphPadPrism7以标准液浓度对相应的OD值作图，并作数据处理，用平均值±标准偏差表示。计算本检测方法的灵敏度(最低检测限lowerlimitconcentration,LLC)和重复性(变异系数thecoefficientofvariation,CV％)。CV值不大于10％，则检测方法视为可重复。3.本专利技术的优点：所需样品量少，低耗材，方法简便，设备简单，检测时间短，人力成本低，便于操作。附图说明图1.HA标准曲线如图所示A为传统法测得OD值与HA浓度的标准曲线；B为半传统法测得的OD值与HA浓度的标准曲线；C为本方法(微量高通量方法)测得的OD值与HA浓度的标准曲线。本方法的标准曲线显示HA浓度和OD值有着很好的相关性，R2值达到0.9916。用传统方法测HA的检测下限为100μg/mL，而用本专利申请方法(高通量法)的检测下限为30μg/mL，OD值≤1为有效测定区间，变异系数CV为2-7％(n＝18)。和传统方法比较，标准曲线呈现有效平行，但本专利申请方法(高通量法)的检测下限更低，检测方法敏感。图2.高通量方法检测类风湿RA大鼠(CIA)免疫前后滑膜匀浆中HA的含量如图所示，与免疫前的大鼠(健康大鼠)相比，RA大鼠滑膜匀浆液中HA的含量显著降低，并与RA发病进程(时间)相关。具体实施方式实施例一：高通量方法检测市场上某品牌面膜中HA的含量取某品牌面膜的面膜液于EP管中，吸取20μL/孔于96孔板中(3个复孔)，置于冰上，各孔缓慢加100μL0.025M四硼酸钠硫酸溶液，混匀，95℃水浴15min后置于冰上迅速冷却，各孔加4μL0.125％咔唑乙醇溶液，混匀后95℃水浴15min，冷却至室温。用酶标仪测定530nm处的OD值。测得的OD值根据标准曲线计算面膜中HA的含量。实施例二：大鼠胶原诱导的类风湿关节炎(CIA)模型，高通量方法体外检测大鼠滑膜匀浆中HA的含量。胶原诱导类风湿大鼠，在方案设定的时间点(免疫前和免疫后，每组3只平行)处死后，取关节腔中的滑膜进行匀浆，每只大鼠滑膜匀浆液吸取10μL/孔于96孔板中(2个复孔)，每孔再加10μLPBS，置于冰上，各孔缓慢加100μL0.025M四硼酸钠硫酸溶液，混匀，95℃水浴15min后置于冰上迅速冷却，各孔加4μL0.125％咔唑乙醇溶液，混匀后95℃水浴15min，冷却至室温。用酶标仪测定530nm处的OD值。测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种涉及到透明质酸(hyaluronic acid,HA)定量快速检测方法，特点在于本方法区别于传统行业标准的紫外分光光度计方法，本专利是关于建立一个使用酶标仪于530nm处进行吸光度(OD值)检测的高通量微量快速方法，步骤如下：A.准备工作：a.配制0.125％咔唑乙醇溶液和0.025M四硼酸钠硫酸溶液；b.HA标准品准备称取适量医用级HA，加入双蒸水稀释，配制成10mg/mL；B.制备HA标准液系列(梯度稀释法)制备HA浓度为0，0.078，0.156，0.312，0.625，1.25，2.50，5.00，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100，200，400，800，1600，3200，6400μg/mL系列标准液(注意：传统法《中华人民共和国医药行业标准YY0308‑透明质酸钠含量测定》中标准液使用葡萄糖醛酸，其系列浓度为0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0μg/mL)。C.微孔(96孔板)快速反应酶标仪检测，即高通量法的建立并和传统法比较a.传统法对照：15mL试管反应产物/紫外分光光度计检测(传统法)参照传统法《中华人民共和国医药行业标准YY0308‑透明质酸钠含量测定》所述方法用试管进行实验，分别取1mL各标准液于各试管中，标记，置于冰水浴中，各管缓慢加5mL0.025M四硼酸钠硫酸溶液，摇匀，95℃水浴15min后冰水浴迅速冷却，各管加0.2mL 0.125％咔唑乙醇溶液，摇匀后95℃水浴15min，冷却至室温。以浓度为0的试管作对照，用紫外分光光度计和比色皿(3mL)测定530nm处的吸光度，每测一个浓度都需要更换比色皿。b.半传统法对照：15mL试管反应产物/酶标仪检测分别取100μL上述在试管中反应的液体，置于微孔(96孔板)中，用酶标仪测定530nm处的吸光度。c.微量高通量法(本专利)：微孔(96孔板)反应产物/酶标仪检测(高通量法)96孔板，分别取20μL各系列浓度的标准液于微孔中，置于冰上；缓慢加100μL 0.025M四硼酸钠硫酸溶液于各孔中混匀；95℃水浴15min后置于冰上将反应物迅速冷却；各孔再加4μL 0.125％咔唑乙醇溶液混匀，95℃水浴15min后，冷却至室温。用酶标仪在530nm处测定吸光度，并以标准HA浓度(横坐标)对相应的吸光度(纵坐标)作标准曲线。检测样品则按标准曲线给出的公式计算样品HA浓度。D.HA微量高通量法的灵敏度和重复性测试重复9次以上HA系列标准浓度微量反应和吸光度的酶标仪检测，使用分析软件GraphPad Prism 7以标准液浓度对相应的OD值作图，并作数据处理，用平均值±标准偏差表示。计算本检测方法的灵敏度(最低检测限lower limit concentration,LLC)和重复性(变异系数the coefficient of variation,CV％)。CV值不大于10％，则检测方法视为可重复。E.应用实例使用本申请建立的方法，检测了类风湿大鼠模型中免疫前和免疫后大鼠滑膜液HA水平的变化，并发现该HA水平的变化与类风湿病变进程相关。另外，使用本申请建立的方法，检测了某品牌面膜中HA的含量。...

【技术特征摘要】
1.一种涉及到透明质酸(hyaluronicacid,HA)定量快速检测方法，特点在于本方法区别于传统行业标准的紫外分光光度计方法，本专利是关于建立一个使用酶标仪于530nm处进行吸光度(OD值)检测的高通量微量快速方法，步骤如下：A.准备工作：a.配制0.125％咔唑乙醇溶液和0.025M四硼酸钠硫酸溶液；b.HA标准品准备称取适量医用级HA，加入双蒸水稀释，配制成10mg/mL；B.制备HA标准液系列(梯度稀释法)制备HA浓度为0，0.078，0.156，0.312，0.625，1.25，2.50，5.00，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100，200，400，800，1600，3200，6400μg/mL系列标准液(注意：传统法《中华人民共和国医药行业标准YY0308-透明质酸钠含量测定》中标准液使用葡萄糖醛酸，其系列浓度为0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0μg/mL)。C.微孔(96孔板)快速反应酶标仪检测，即高通量法的建立并和传统法比较a.传统法对照：15mL试管反应产物/紫外分光光度计检测(传统法)参照传统法《中华人民共和国医药行业标准YY0308-透明质酸钠含量测定》所述方法用试管进行实验，分别取1mL各标准液于各试管中，标记，置于冰水浴中，各管缓慢加5mL0.025M四硼酸钠硫酸溶液，摇匀，95℃水浴15min后冰水浴迅速冷却，各管加0.2mL0.125％咔唑乙醇溶液，摇匀后95℃水浴15min，冷却至室温。以浓度为0的试管作对照，用紫外分光光度计和比色皿(3mL)测定530nm处的吸光度，每测一个浓度都需要更换比色皿。b.半传统法对照：15mL试管反应产物/酶标仪检测分别取100μL上述在试管中反应的液体，置于微孔(96孔板)中，用酶标仪测定530nm处的吸光度。c.微量高通量法(本专利)：微孔(96孔板)反应产物/酶标仪检测(高通量法)96孔板，分别取20μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晓鹰，魏涛，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32