高效表达重组人神经生长因子的基因组合制造技术

本发明专利技术选择了优化的重组人神经生长因子的基因表达调控元件，提供了高效表达rhNGF的基因组合。该组合提高了rhNGF的表达水平，经实验证实，本发明专利技术提供的基因组合在真核表达系统中高效表达具有天然活性的重组人神经生长因子。

【技术实现步骤摘要】
高效表达重组人神经生长因子的基因组合
：本专利技术涉及生物
，特别涉及一种在真核表达系统中高效表达具有天然活性的重组人神经生长因子(rhNGF)的基因组合。
技术介绍
：NGF具有神经元营养和促轴突生长双重生物学功能，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。NGF在体内以前体形式(proNGF)合成，包括“基因B”、前导肽和成熟NGF。“基因B”有助于蛋白的分泌；前导肽中有两部分保守区域为proNGF表达、酶解形成具有生物活性的蛋白以及成熟NGF的分泌所必需，且其还有助于蛋白的正确折叠。proNGF包含潜在的N糖基化位点，proNGF中前导肽的糖基化有助于其出内质网。proNGF经弗林蛋白酶或激素酶原转化酶在特定部位水解后形成具有生物学活性的成熟NGF。成熟NGF有118个氨基酸，呈双链二聚体结构。单链内共有6个半胱氨酸残基，可对应形成3对链内二硫键(Cys58-Cys108，Cys68-Cys110，Cys15-Cys80)，二硫键的正确形成是NGF具有活性的必要条件。我国是世界上第一个也是唯一一个批准注射用mNGF(鼠神经生长因子)上市的国家。mNGF与人神经生长因子(hNGF)在蛋白质氨基酸序列上有10％差异，作为异源蛋白质长期使用有潜在的安全性问题，且存在鼠源病毒污染风险。20世纪90年代起，国外多家制药公司和研发机构相继开始研究重组人神经生长因子，但迄今尚未有开发成功的rhNGF产品上市。其主要原因是NGF表达水平低、表达产物生物学活性差以及hNGF与mNGF的同源性问题。例如，意大利Dompé公司研发的rhNGF滴眼液于2017年7月6日获欧洲药品管理局批准用于中度至重度神经营养性角膜炎的治疗，其中的活性成分rhNGF采用大肠杆菌表达系统以proNGF形式进行表达，由于该系统缺乏有效的翻译后修饰功能，不利于成熟NGF蛋白的正确折叠，表达产物为包涵体，后续工艺需要体外复性、蛋白酶切除前导肽才能获得目标蛋白，导致生产工艺复杂、产物得率低、生产成本高等缺点。在真核表达系统中高效表达rhNGF是目前需要解决的技术难题。因为高效表达载体是实现rhNGF高产率的主要因素。在表达载体构建过程中采用合适的表达调控序列和合理的结构排列，可以提高rhNGF的表达水平。
技术实现思路
本专利技术的目的是优化重组人神经生长因子的基因表达调控元件，提供高效表达rhNGF的基因组合。本专利技术人发现，通过选择适当的调控元件与人神经生长因子前体基因(以下亦简称为proNGF基因)进行连接，可以显著提高在真核表达系统中rhNGF的表达水平。本专利技术提供了一种高效表达rhNGF的基因组合，所述组合为：“基因B—基因A”；所述基因A，其核苷酸序列如SEQIDNo.7所示，称为proNGF基因，包含前导肽基因和成熟hNGF，编码SEQIDNo.8所示序列的氨基酸；所述基因B，其核苷酸序列如SEQIDNo.3(简称Pre)，或SEQIDNo.5(简称Luc)所示，它们编码SEQIDNo.4或SEQIDNo.6所示序列的氨基酸。本专利技术提供了第二种高效表达rhNGF的基因组合，还包括有基因C的元件，连接顺序为：“基因C—基因B—基因A”；所述基因C，其核苷酸序列如SEQIDNo.1(简称glo)，或SEQIDNo.2(简称aden)所示。经实验证实，本专利技术提供的基因组合可以提高rhNGF的分泌效率，进而提高rhNGF的表达水平。所述基因组合构建至表达载体。所述表达载体为真核表达载体，可以通过瞬时转染或稳定转染的方式导入宿主细胞。所述宿主细胞为哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾293细胞、COS细胞或Hela细胞。具体地，本专利技术进行了如下研究工作：1、从蛋白质序列数据库UniProtKB中查询hNGF的氨基酸序列，获得ID为P01138的proNGF序列，如SEQIDNo.8所示，由金斯瑞生物科技有限公司根据CHO细胞表达的特点将proNGF氨基酸序列逆翻译为DNA序列并合成，如SEQIDNo.7所示。2、在proNGF的5’端分别添加“基因B”Pre、Luc，如SEQIDNo.3、SEQIDNo.5所示，获得不同“基因B”—proNGF基因组合，将其插入到真核表达载体中，通过瞬时转染导入CHO细胞，经培养后离心取上清，利用ELISA测定上清中rhNGF的含量，以proNGF的天然“基因B”为对照，基因序列如SEQIDNo.9(简称Nat)所示，编码的氨基酸序列如SEQIDNo.10所示，比较不同“基因B”引导下的rhNGF表达水平。3、利用限制性内切酶将“基因C”glo(如SEQIDNo.1所示)、aden(如SEQIDNo.2所示)分别构建至2所述表达载体中，获得含有“基因C”—“基因B”—proNGF基因组合的真核表达载体，以2所述载体为对照，通过2所述方法评估“基因C”对rhNGF瞬时表达的影响。4、将3所述表达载体转染CHO细胞中，同时加入嘌呤霉素(puromycin)和甲氨蝶呤(MTX)进行两轮加压筛选以获得细胞池。5、选择比产率高、细胞生长良好的细胞池利用有限稀释法进行单克隆，筛选获得高效表达rhNGF的工程细胞株。6、生物反应器中测定工程细胞株的生长曲线、细胞活率及rhNGF表达水平的变化趋势。7、采用TF-1细胞/MTS比色法测定rhNGF的生物学活性。经实验证实，本专利技术提供的“基因B—proNGF”基因组合，相较于NGF天然基因组合，在真核表达系统中，rhNGF瞬时表达水平显著性提高(见实施例1)；在所述“基因B—proNGF基因”组合5’端添加“基因C”可以进一步显著性提高rhNGF的瞬时表达水平(见实施例1)；基于所述“基因C—基因B—proNGF”基因组合构建的工程细胞株在生物反应器中培养，上清中rhNGF的表达量达78mg/L(见实施例2、3)，生物学活性与国际标准品相当，强于注射用mNGF(见实施例4)。附图说明图1：含有“基因B”—proNGF基因组合的真核表达载体p-Pre/Nat/Luc–pro-rhNGF(SfiI)－1的SfiI酶切检测，其中：M：DL5000DNAMarker；1：p-Pre-pro-rhNGF-8，SfiI酶切；2：p-Pre-pro-rhNGF(SfiI)-1，SfiI酶切；3：p-Nat-pro-rhNGF(SfiI)-1，SfiI酶切；4：p-Luc-pro-rhNGF(SfiI)-1，SfiI酶切。图2：含有“基因B”—proNGF基因组合的真核表达载体p-Pre/Nat/Luc–pro-rhNGF(SfiI)－1的AvrII、BstZ17I双酶切检测，其中：M：DL5000DNAMarker；1：p-Pre-pro-rhNGF(SfiI)-1，AvrII、BstZ17I双酶切；2：p-Nat-pro-rhNGF(SfiI)-1，AvrII、BstZ17I双酶切；3：p-Luc-pro-rhNGF(SfiI)-1，AvrII、BstZ17I双酶切。图3：左右二图分别是两次“基因B”—proNGF基因组合对rhNGF瞬时表达的影响实验的结果。图4：左右二图分别是两次“基因C”—“基因B”—pro本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效表达rhNGF的基因组合，所述组合为：“基因B—基因A”；所述基因A，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述基因B，其核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。

【技术特征摘要】
1.一种高效表达rhNGF的基因组合，所述组合为：“基因B—基因A”；所述基因A，其核苷酸序列如SEQIDNo.7所示；所述基因B，其核苷酸序列如SEQIDNo.3或SEQIDNo.5所示。2.权利要求1所述的基因组合在制备rhNGF中的应用。3.权利要求1所述的基因组合，还包括有基因C的元件，连接顺序为...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海，孙洪亮，张怡，
申请(专利权)人：江苏中新医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32