抗SARS-CoV-2(COVID-19)S蛋白RBD单克隆抗体制造技术

本发明专利技术提供了一种抗SARS

【技术实现步骤摘要】
抗SARS
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CoV
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2(COVID
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19)S蛋白RBD单克隆抗体

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[0001]本专利技术涉及基因工程抗体，特别涉及针对新冠病毒S
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RBD靶点开发的单克隆抗体药物。

技术介绍
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[0002]已知新冠病毒SARS
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19)是通过其S蛋白的受体结合结构域(RBD)与宿主受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，介导病毒进入宿主细胞而感染的。S蛋白包含两个功能性亚基S1和S2，其中S1负责与宿主细胞受体结合，S2亚基负责病毒膜和细胞膜融合。在感染过程中，S蛋白被宿主蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，并从融合前状态转变为融合后状态。S1和S2由胞外结构域(ECD)和单个跨膜螺旋组成，分别介导受体结合和膜融合。S1由N端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)组成，对决定组织嗜性和宿主范围至关重要。
[0003]SARS
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CoV
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19)的S蛋白的受体结合结构域(RBD)是免疫显性的，也是SARS
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2免疫血清中存在的90％中和抗体的靶点。因此，针对新冠病毒S
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RBD靶点及其突变体开发抗体药物是治疗新冠病毒感染患者的有效途径，据此开发的单克隆抗体有潜力成为新冠病毒感染治疗的特效药。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种单克隆抗体，可以有效与ACE2竞争结合SARS
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CoV
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19)S蛋白RBD及其突变体(L452R，T478K)，用于制备治疗新型冠状病毒相关疾病的药物。
[0005]本专利技术用SARS
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CoV
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19)S蛋白RBD蛋白及其突变体(L452R，T478K)蛋白免疫BALB/c小鼠，获得了全新的抗SARS
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CoV
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19)S蛋白RBD单克隆抗体。
[0006]本专利技术获得的抗SARS
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CoV
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19)S蛋白RBD单克隆抗体的重链和轻链序列，与现有技术抗SARS
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CoV
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19)S蛋白RBD单克隆抗体均完全不同。
[0007]所用的SARS
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19)S蛋白RBD蛋白购买自北京百普赛斯生物科技股份有限公司，所用的小鼠为BALB/c小鼠。
[0008]具体的，本专利技术通过如下手段完成了上述工作：
[0009]A SARS
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CoV
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19)S蛋白RBD蛋白作为抗原，以30μg/只免疫BALB/c小鼠，三周后同样剂量加强免疫；
[0010]B ELISA法测定免疫后小鼠血清中的抗体滴度，达到理想效果后以50μg剂量冲击免疫；
[0011]C取免疫成功的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，待细胞长成细胞团后进行上清滴度检测，通过三轮亚克隆获得阳性单克隆细胞株；
[0012]D单克隆细胞株扩大培养后进行小鼠腹腔注射制备腹水，并从收集的腹水纯化得到相应的抗体；
[0013]E利用SPR技术进行单克隆抗体的亲和动力学测定；
[0014]F测定单克隆抗体对SARS
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CoV
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19)S蛋白RBD及其突变体(L452R，T478K)与ACE2结合的竞争抑制作用；
[0015]G测定单克隆抗体对于新冠假病毒及其突变株(Delta)假病毒的中和活性。
[0016]本专利技术获得的抗SARS
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CoV
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19)S蛋白RBD单克隆抗体命名为B15
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B3。此抗体特异性的分子基础主要来自于它的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3，这些区域是与抗原结合的关键部位。
[0017]本专利技术获得的抗SARS
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CoV
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2(COVID
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19)S蛋白RBD单克隆抗体的重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3分别是如下所示氨基酸序列的多肽：
[0018]B15
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B3：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
[0019]本专利技术所述“单克隆抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，可以是单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。
[0020]本专利技术所述单克隆抗体的实例是免疫球蛋白IgG亚型及其亚型亚类；
[0021]尽管抗体特异性的分子基础主要来自于它的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3，为了维持优选的结合特性，上述CDR的序列应尽可能保留。然而，尽管如果有个别氨基酸的改变，也有可能能够达到本专利技术目的，甚至使结合特性更为优化。但是，个别氨基酸的改变并不能脱离本专利技术的构思和专利技术精神。
[0022]除了如上所述重链和轻链中的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3外，其它为框架区。框架区可在结合所需的三维结构不受影响的条件下被其他序列置换。
[0023]用本专利技术获得的抗SARS
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19)S蛋白RBD单克隆抗体B15
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B3进行了如下实验验证：
[0024]1、亲和动力学分析
[0025]结果表明，本专利技术的单克隆抗体与SARS
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CoV
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19)S蛋白RBD及其突变体(L452R，T478K)均具有高亲和力(详见实施例2)。
[0026]2、与ACE2结合的竞争抑制作用
[0027]生化水平实验结果表明，本专利技术的单克隆抗体能明显抑制SARS
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CoV
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19)S蛋白RBD及其突变体(L452R，T478K)与ACE2结合(详见实施例3)。
[0028]3、对新冠假病毒及其突变株(Delta)假病毒中和活性检测
[0029]结果表明，本专利技术的单克隆抗体对新冠假病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗SARS
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CoV
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19)S蛋白RBD单克隆抗体，含有氨基酸序列如下所示的多肽中的一个或多个：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。2.氨基酸序列如下所示的多肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。3.权利要求2所述的多肽中的一个或多个在制备抗SARS
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19)S蛋白RBD单克隆抗体中的应用。4.权利要求2所述的多肽中的一个或多个在制备新型冠状病毒及其突变株的中和抗体药物中的应用。5.两组多肽，每组各包含三个多肽，氨基酸序列如下所示：1组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖高勇，丁海剑，陈海，张怡，
申请(专利权)人：江苏中新医药有限公司，
类型：发明
国别省市：