抗胞外-5制造技术

本发明专利技术用人胞外

【技术实现步骤摘要】
抗胞外
‑5’‑
核苷酸酶的抗体序列

：
[0001]本专利技术涉及基因工程抗体，特别涉及多种抗胞外
‑5’‑
核苷酸酶的抗体序列。

技术介绍
：
[0002]胞外
‑5‘‑
核苷酸酶(ecto
‑5’‑
nucleotidase，以下亦简称为CD73)，是多功能的胞外核酸酶，广泛分布于包括T、B淋巴细胞，巨噬细胞，树突状细胞，血管内皮，黏膜上皮细胞在内的多种组织细胞，在细胞内可同时发挥酶和非酶功能。
[0003]研究证实，CD73过表达可以促进肿瘤细胞的增殖，且在大多数实体瘤中呈高表达，包括结直肠癌、卵巢癌、胃癌、胆囊癌、前列腺癌等，并与肿瘤分期、病理类型以及预后转归密切相关；CD73
‑
腺苷途径在肿瘤进展和免疫逃逸中起着极其重要的作用，靶向CD73能够明显提高CTLA
‑
4以及PD
‑
1抑制剂的抗肿瘤效应，CD73有望成为未来肿瘤免疫治疗的特效靶点。
[0004]尽管目前已经有人研发了一些治疗型CD73单克隆抗体，其中，以MEDI
‑
9447和天镜生物的CD73抗体为代表。但是，抗体是B淋巴细胞在抗原刺激下所产生的具特异性免疫功能的球蛋白，单克隆抗体是由单个克隆的杂交瘤细胞分泌的，只能识别一种表位(抗原决定簇)的抗体。而针对同一个生物大分子的不同抗原表位可以制备出多种不同的单克隆抗体，即使抗原表位相同，获得的单抗序列也有可能不同。不同的序列以及靶位可能带来更优的药效或者更低的毒性以及更为广泛的抗瘤谱，开发出更多的抗胞外
‑5’‑
核苷酸酶的抗体序列，才有可能解决更多的临床问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供多种有效的抗胞外
‑5’‑
核苷酸酶(即CD73)的抗体序列，以用于制备治疗肿瘤相关疾病的药物。
[0006]本专利技术用人源CD73蛋白免疫小鼠，分别获得了五个抗CD73单克隆抗体，这些单克隆抗体的重链和轻链序列，均是全新的序列，现有技术未见报道过。
[0007]本专利技术获得的五个抗CD73单克隆抗体中，其中四个抗体与现有技术抗体识别的抗原表位也不同。
[0008]所用的CD73蛋白为申请人自主表达的人源CD73蛋白，所用的小鼠为BABL/C小鼠。
[0009]具体的，本专利技术通过如下手段完成了上述工作：
[0010]A人源CD73蛋白作为抗原以30μg/只免疫BABL/C小鼠，三周后同样剂量加强免疫；
[0011]B ELISA法测定免疫后小鼠血清中的抗体滴度，达到理想效果后以50μg剂量冲击免疫；
[0012]C取免疫成功的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，待细胞长成细胞团后进行上清滴度检测，通过三轮亚克隆获得阳性单克隆细胞株；
[0013]D单克隆细胞株扩大培养后进行小鼠腹腔注射制备腹水，并从收集的腹水纯化得到相应的抗体；
[0014]E利用SPR技术进行单克隆抗体的亲和动力学测定；
[0015]F测定单克隆抗体对于CD73酶活性的抑制作用；
[0016]G测定单克隆抗体对于移植瘤模型的肿瘤抑制作用。
[0017]本专利技术获得的五个抗CD73单克隆抗体分别命名为：F2
‑
2、E1
‑
B6、81
‑2‑
2、06
‑
6和9
‑
4。这些抗体特异性的分子基础主要来自于它的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3，这些区域是与抗原结合的关键部位。
[0018]本专利技术获得的五个抗CD73单克隆抗体中，每个抗体的重链和中的CDR1、CDR2和CDR3分别是如下所示氨基酸序列的多肽：
[0019]F2
‑
2：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
[0020]E1
‑
B6：SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；
[0021]81
‑2‑
2：SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19；SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；
[0022]06
‑
6：SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27；SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30；
[0023]9‑
4：SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35；SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38。
[0024]本专利技术所述“单克隆抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，可以是单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。
[0025]本专利技术所述单克隆抗体的实例是免疫球蛋白IgG亚型及其亚型亚类；
[0026]尽管抗体特异性的分子基础主要来自于它的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3，为了维持优选的结合特性，上述CDR的序列应尽可能保留。然而，尽管如果有个别氨基酸的改变，也有可能能够达到本专利技术目的，甚至使结合特性更为优化。但是，个别氨基酸的改变并不能脱离本专利技术的构思和专利技术精神。
[0027]除了如上所述重链和轻链中的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3外，其它为框架区。框架区可在结合所需的三维结构不受影响的条件下被其他序列置换。
[0028]本专利技术的有益效果：
[0029]经实验证实，本专利技术所生产的五个抗CD73单克隆抗体具有以下突出特点：
[0030]1、与人CD73具有高亲和力(详见实施例2)
[0031]2、与现有技术抗CD73单克隆抗体识别的抗原表位不同(详见实施例3)
[0032]3、生化水平实验和细胞水平实验都显示具有高效的CD73酶活抑制作用(详见实施例4)
[0033]4、可显著抑制人免疫重构鼠移植瘤的生长(详见实施例5)。
附图说明
[0034]图1本专利技术的5个抗CD73单克隆抗体获得步骤的示意图；
[0035]图2为实施例2(F2
‑
2、E1
‑
B6、81
‑2‑
2、06
‑
6和9
‑
4抗体与人CD73的亲和力)的实验结
果，图中Ka、Kd和KD分别为结合常数、解离常数以及亲和力常数，Contbody为MEDI
‑
9447；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.以下氨基酸序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、EQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38。2.权利要求1所述氨基酸序列中的一个或多个在制备抗CD73单克隆抗体中的应用。3.权利要求1所述氨基酸序列中的一个或多个在制备CD73酶活抑制剂中的应用。4.权利要求1所述氨基酸序列中的一个或多个在制备抗肿瘤药物中的应用。5.以下组合中一个组合或两个组合在制备抗CD73单克隆抗体中的应用，每个所述组合的氨基酸序列如下所示：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19；SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27；SEQ ID NO.28、SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖高勇，丁海剑，王灵，张怡，
申请(专利权)人：江苏中新医药有限公司，
类型：发明
国别省市：