A low-cost and high-throughput optimization method for aptamers based on base Quenching Fluorescence principle belongs to the field of molecular biology, which includes: dividing the long-chain aptamers into several segments containing G bases; designing complementary sequences for the segments containing G bases, so that the 3'end of the complementary sequence has the opposite position. A prominent G-base, a suitable length of complementary short chains, a fluorescein-labeled complementary short chains were added to the nucleic acid aptamer after reacting with the target molecule in the binding solution, and the binding region was judged according to the fluorescence intensity. Short, segmentation and other means are used to obtain the shortest nucleic acid sequences that can be combined with target molecules. The optimized method has the advantages of faster speed, fewer fluorescent sequences needed for labeling, versatility of labeled fluorescent probes, simultaneous optimization of multiple nucleic acid sequences and characterization of binding ability of newly designed aptamer sequences.
【技术实现步骤摘要】
一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法
本专利技术属于分子生物学领域,涉及一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法。
技术介绍
核酸适配体(Aptamer,也译为核酸识体、核酸适体、适配体)是指通过指数富集配体系统进化法(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,SELEX),从人工合成的DNA或RNA文库中筛选出来的、能够对靶标高亲合性地结合和高特异性识别的单链寡核苷酸。随机文库的基本序列结构包括:中间随机序列长度为35-60个碱基,两端用于扩增的引物长度为约20个碱基。最终筛选到的核酸适配体的总长度约60-100个碱基。核酸适配体可以形成独特的三维结构,这使得核酸适配体可以更好地和靶标相结合,核酸适配体的靶标小到离子、单分子,大到整个细胞。核酸适配体对于靶标具有很好的选择性和很强的亲和力,这使其具有超过传统识别元素的优势,在某种程度上可以与抗体相媲美。因此核酸适配体替代传统抗体在多种疾病的基础研究、药物筛选、临床诊断及疾病治疗中具有广泛的应用前景。在已报道研究中发现核酸适配体长度过长不利于形成稳定的结构,且易引起不必要的碱基错配,从而影响识别过程。而通过去除与识别区域不相关对的非必需序列,仅保留识别的核心区域,可以使核酸适配体长度大大缩短,并提高核酸适配体与靶标结合的亲和力和特异性,便于后续研究,同时也节省了合成成本。当前,已被广泛应用的核酸适配体,例如凝血酶适配体、ATP适配体、IgE适配体等,其核心序列长度在15-30个碱基水平。 ...
【技术保护点】
1.一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法,其特征在于以下步骤:(1)将已获得长链核酸适配体作为候选核酸适配体,分成若干个含有G碱基的段,其中每一个段至少含有一个G碱基;(2)对第一步得到的若干个含有G碱基的段分别设计互补序列,使得互补序列的3’端的对位有G碱基;(3)根据核酸适配体与靶标分子的结合能力,设计合适的互补短链的长度,并对互补短链进行荧光素标记;(4)室温下,将核酸适配体与靶标分子在结合溶液中反应5‑30分钟后,加入荧光素标记的互补短链,根据荧光强度判断各个区域对结合的影响,判断结合区域;所述的结合溶液包括溶剂和溶质,其中,溶剂为水;溶质包括NaCl,钙离子或镁离子,Tris‑HCl缓冲溶液,表面活性剂;(5)以与中心结合区域互补的探针为指示,通过截短、分割手段获得能与靶标分子结合的最短核酸序列,作为解析序列;所述的解析序列的长度范围根据候选核酸适配体的不同进行调整。
【技术特征摘要】
1.一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法,其特征在于以下步骤:(1)将已获得长链核酸适配体作为候选核酸适配体,分成若干个含有G碱基的段,其中每一个段至少含有一个G碱基;(2)对第一步得到的若干个含有G碱基的段分别设计互补序列,使得互补序列的3’端的对位有G碱基;(3)根据核酸适配体与靶标分子的结合能力,设计合适的互补短链的长度,并对互补短链进行荧光素标记;(4)室温下,将核酸适配体与靶标分子在结合溶液中反应5-30分钟后,加入荧光素标记的互补短链,根据荧光强度判断各个区域对结合的影响,判断结合区域;所述的结合溶液包括溶剂和溶质,其中,溶剂为水;溶质包括NaCl,钙离子或镁离子,Tris-HCl缓冲溶液,表面活性剂;(5)以与中心结合区域互补的探针为指示,通过截短、分割手段获得能与靶标分子结合的最短核酸序列,作为解析序列;所述的解析序列的长度范围根据候选核酸适配体的不同进行调整。2.根据权利要求1所述的一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法,其特征在于,步骤(1)所述的候选核酸适配体为一种序列或多种序列,包括60-100个碱基。3.根据权利要求1或2所述的一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法,其特征在于,步骤(3)所述的互补链长度为8-15个碱基。4.根据权利要求1或2所述的一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法,其特征在于,步骤(5)所述的解析序列的长度为14-45个碱基。5.根据权利要求3所述的一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化...
【专利技术属性】
技术研发人员:杨成,宋彩侨,孙迎迎,
申请(专利权)人:大连理工大学,
类型:发明
国别省市:辽宁,21
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