一种磷光探针选择性检测凝血酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种磷光探针选择性检测凝血酶的方法。它是利用凝血酶适配体（TBA）与凝血酶之间具有较强的特异性结合，从而使MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点与凝血酶适配体，混合猝灭体系中的TBA离开量子点表面，导致体系磷光强度恢复。相对于荧光量子点，磷光量子点因其磷光寿命长、可避免自体荧光和散色光的干扰、选择性强、检测时无需加入任何除氧剂和诱导剂等优点，在检测中运用更加广泛。在本发明专利技术中磷光量子点和TBA均未修饰，很大程度的简化了合成步骤，同时也降低了实验成本。该方法准确度高，灵敏度高，在实际样品的检测中都有很好的应用前景。

A method for selective detection of thrombin by phosphorescent probe

The invention discloses a method for selectively detecting thrombin by a phosphorescent probe. It has a strong specific binding between the thrombin aptamer (TBA) and the thrombin, thus making the MPA coated Mn doped ZnS phosphorescent quantum dots and thrombin aptamers. The TBA in the mixed quenching system leaves the surface of the quantum dots, resulting in the recovery of the phosphorescence intensity of the system. Compared with the fluorescence quantum dots, phosphor quantum dots are widely used in detection because of their long phosphor life, avoiding the interference of autofluorescence and diffuse light, selectivity, and without any deoxidizer and inducer in detection. The phosphorescent quantum dots and TBA are not modified in the invention, which greatly simplifies the synthesis steps and reduces the experimental cost. The method has high accuracy and high sensitivity, and has a good application prospect in the detection of real samples.

【技术实现步骤摘要】
一种磷光探针选择性检测凝血酶的方法本专利受到国家自然科学基金面上项目2137509，天津市自然科学基金青年项目（No.17JCQNJC05800）和天津师范大学博士基金项目（No.52XB1510）的资助。
本专利技术属于生物分析检测
，主要涉及一种免标记磷光探针对凝血酶定量检测的应用。
技术介绍
近年来，以掺杂量子点为标记物的荧光分析法已经引起了国内外研究学者的广泛关注，成为当前科学研究的一大热点。在量子点中引入杂质离子会改变量子点的光、电、磁性质。因为掺杂能引起一些在非掺杂量子点中不可能出现的光特性，所以杂质离子对量子点光学性质的改变尤其重要。例如Mn离子掺杂后形成的Mn掺杂ZnS量子点与ZnS量子点相比具有特殊的室温磷光性质。室温磷光（RTP）量子点检测受到了广泛的关注，已广泛应用于传感器，特别是生物分子传感器。相比较于其他检测模式，磷光检测模式有很多优点。由于磷光寿命的延长，且不受自荧光或散射光的干扰，所以RTP量子点检测具有较高的可靠性和稳定性。此外，由于磷光比荧光更不常见，因此检测选择性进一步增强。RTP传感器的发展前景广阔，因为其他的大多数生物传感器需要进行其他复杂的预处理。RTP传感器大多研究纯猝灭体系，“off-on”体系的研究还很少。凝血酶（TB）是血液中的丝氨酸蛋白酶，可将可溶性纤维蛋白转化为不溶性纤维蛋白，促进血液凝固。它在多种生命过程中起着重要作用，并与许多疾病有关，如血栓栓塞性疾病、炎症反应、心血管疾病和抗凝血疗法。因此，对凝血酶的敏感性测定在临床研究和诊断中具有重要意义。凝血酶适配体（TBA）含有15个碱基，其中含有丰富的鸟嘌呤（G），它与凝血酶有较强的特异性结合。TBA被认为是用于临床使用的一种有价值的、经典的凝血酶抑制剂，因为当使用肝素、华法林和比伐卢定，表现出严重的副作用或狭窄的治疗窗。TBA在折叠成一个反平行的结构时，可以强烈且有选择性地识别人凝血酶的纤维蛋白原结合外位点，抑制其在凝固级联中的关键作用。本专利技术所用磷光材料与专利ZL201510230335.7（磷光量子点在生物体液和酒中选择性检测谷胱甘肽的应用）、ZL201410140175.2（一种磷光量子点Mn-ZnS的制备方法及铁形态分析中的应用）中所用一致，但是用于检测的体系的物质不一样。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服传统荧光量子点的不足，提供基于磷光量子点为探针检测凝血酶的方法，目的是利用凝血酶适配体（TBA）与凝血酶之间具有较强的特异性结合，从而使MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点与凝血酶适配体（TBA）混合猝灭体系中的TBA离开量子点表面，导致体系磷光强度恢复。相对于荧光量子点，磷光量子点因其磷光寿命长、可避免自体荧光和散色光的干扰、选择性强、检测时无需加入任何除氧剂和诱导剂等优点，在检测中运用更加广泛。在本专利技术中磷光量子点和TBA均未修饰，很大程度的简化了合成步骤，同时也降低了实验成本。本专利技术运用的是“off-on”的磷光检测模式，这种体系可以显著提高检测的灵敏度和选择性。综上，该方法准确度高，灵敏度高，在实际样品的检测中都有很好的应用前景。为实现上述目的，本专利技术公开了如下的
技术实现思路
：（1）MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液的制备（Wu,P.,He,Y.,Wang,H.-F.,Yan,X.P.,2010.Anal.Chem.82,1427–1433.）准确称取0.0020g纯化后的量子点粉末，溶解于4mL的高纯水中，摇匀备用，浓度为500mg/L；（2）不同pHTris-HCl缓冲液的配制准确称取Tris-HCl固体0.7886g于50mL离心管中，加入40mL高纯水,然后加入0.1M的NaOH溶液，调节pH至6.0,6.5,7.0,7.2,7.4,7.6,7.8,8.5,9.0，最后加高纯水定容至50mL。（3）不同浓度TBA溶液的配制分别取100μM凝血酶适配体溶液10μL,30μL,40μL,50μL,60μL,70μL,80μL,90μL,100μL,110μL,用高纯水定容至1mL，得到1μM,3μM,4μM,5μM,6μM,7μM,8μM,9μM,10μM,11μMTBA梯度浓度溶液。（4）不同浓度凝血酶溶液的配制加1mL自制生理盐水至装有0.85mg凝血酶的小瓶中，配置浓度为22.3μM的凝血酶原液。分别取22.3μM的凝血酶原液1μL,4μL,5μL,20μL,30μL,40μL,70μL,用高纯水定容至100μL，得到0.223μM,0.892μM,1.115μM,4.46μM,6.69μM,8.92μM,15.61μM,17.84μM,22.3μM凝血酶梯度浓度溶液。自制生理盐水配方为：称取0.8克氯化钠，溶解在少量高纯水中，稀释到100毫升。（5）采用磷光法为检测手段，用MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点对凝血酶进行特异性检测：①向离心管中依次加入5-50μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=6.0-9.0Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL梯度浓度（1μM-11μM）TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至500μL。摇匀静置1-40min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315nm进行检测。②向离心管中依次加入5-50μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=6.0-9.0Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL梯度浓度（1μM-11μM）TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至450μL。摇匀静置1-40min，待其磷光猝灭达到平衡状态后，加入50μL梯度浓度（0.223-22.3μM）凝血酶溶液作为磷光恢复剂。摇匀静置1-45min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315nm进行检测。本专利技术更进一步公开了免标记且结合凝血酶适配体的“off-on”型磷光探针定量检测凝血酶的方法在提高检测的灵敏度和选择性方面的应用。实验结果显示本专利技术所提供的检测方法有较宽的检测范围和较低的检出限，检测凝血酶的过程简单、高效、经济、环保。本专利技术利用猝灭剂TBA与具有独特光学性能的MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点之间的相互作用，使得反应体系处于磷光猝灭。随后目标物凝血酶的加入，目标物分子凝血酶与猝灭剂TBA之具有特异性结合的作用，使得被猝灭的磷光强度逐渐恢复。通过磷光强度的变化值和线性方程计算得出待测液中凝血酶的浓度，以此实现对凝血酶的快速、高效、选择性检测。本专利技术利用的MPA包覆的Mn掺杂ZnS磷光量子点作为磷光探针选择性检测凝血酶含量，方法简便、快捷不需要复杂的功能化和样品前处理过程就可以实现对凝血酶的选择性检测。本方法可以有效的避免常用的检测方法如分光光度法、化学发光法、液相色谱法和电化学方法等方法存在的检测时间长、检测过程复杂、有些样品需进行前处理、仪器昂贵、抗干扰能力差、检测灵敏度低等缺点。在众多的基于量子点而开发的光学分析探针中，Mn掺杂量子点不仅可以提高主体量子点的发光效率和稳定性，同时还可以产生室温磷光发射这种特殊的光致发光现象，具有磷光寿命长、选择性强、生物自体荧光和散射光的干扰小、检测时无需加入任何除氧剂和诱导剂等优点，非常本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免标记且结合凝血酶适配体的“off‑on”型磷光探针定量检测凝血酶的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）向离心管中依次加入5‑50 μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50 μL (0.1M) pH=6.0‑9.0 Tris‑HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50 μL梯度浓度（1 μM‑11 μM）TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至500 μL，摇匀静置1‑40 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测；（2）向离心管中依次加入5‑50 μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50 μL (0.1M) pH=6.0‑9.0 Tris‑HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50 μL梯度浓度（1μM‑11 μM）TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至450 μL，摇匀静置1‑40 min，待其磷光猝灭达到平衡状态后，加入50 μL梯度浓度（0.223‑22.3μM）凝血酶溶液作为磷光恢复剂，摇匀静置1‑45 min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315 nm进行检测；（3）以步骤（1）对磷光量子点探针的磷光进行猝灭，以步骤（2）对量子点的磷光进行恢复，并以其对步骤（1）的磷光恢复响应值为检测信号，检测样品中凝血酶的浓度；凝血酶样品须溶解于自制生理盐水中，自制生理盐水配方为：称取0.8克氯化钠，溶解在少量高纯水中，稀释到100毫升；高纯水须用0.45 μm水系膜过滤。...

【技术特征摘要】
1.一种免标记且结合凝血酶适配体的“off-on”型磷光探针定量检测凝血酶的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）向离心管中依次加入5-50μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=6.0-9.0Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL梯度浓度（1μM-11μM）TBA溶液作为磷光猝灭剂，加高纯水定容至500μL，摇匀静置1-40min后，将荧光分光光度计调成磷光检测模式，设置激发波长为315nm进行检测；（2）向离心管中依次加入5-50μLMPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点母液，50μL(0.1M)pH=6.0-9.0Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，再向其中加入50μL梯度浓度（1μM-11μM）TBA溶液作为磷光猝灭剂，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李妍，熊艳，叶雨萌，张菲，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津,12