人造双向植物启动子制造技术

本公开涉及用于促进核苷酸序列在植物或植物细胞中的转录的组合物和方法，所述组合物和方法使用来自拟南芥泛素‑10基因启动子或木薯叶脉花叶病毒启动子的最小核心启动子元件，以及来自木薯叶脉花叶病毒启动子的全长核苷酸序列元件。一些实施方案涉及可在植物中起作用以促进两个可操作连接的核苷酸序列的转录的人造的CsVMV双向启动子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人造双向植物启动子优先权要求本申请要求2014年11月11日提交的“SYNTHETICBI-DIRECTIONALPLANTPROMOTER”的美国临时专利申请序号62/078,205的申请日的权益。
本公开一般涉及用于促进植物或植物细胞中核苷酸序列的转录的组合物和方法。一些实施方案涉及可在植物中起作用以促进可操作连接的核苷酸序列的转录的人造木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)双向启动子。具体实施方案涉及包括人造启动子(例如，将核酸分子引入细胞)的方法和包含人造启动子的细胞、细胞培养物、组织、生物体、以及生物体的部分，以及由其产生的产物。专利技术背景许多植物物种可以用来自其他物种的转基因转化以引入农学上期望的性状或特征，例如改善营养价值品质、提高产率、赋予害虫或疾病抗性、提高干旱和应激耐受性、改善园艺质量(如着色和生长)、给予除草剂抗性、使得能够从植物产生工业上有用的化合物和/或材料、和/或使得能产生药物。将转基因导入到植物细胞、随后复原含有稳定整合的转基因拷贝的可育转基因植物的做法，可以导致生成拥有期望性状或特征的转基因植物。基因表达的控制和调节的运行机制众多。基因的转录启动是基因表达的主要控制机制。转录的启动一般由位于所转录基因的5’侧翼或上游区中的多核苷酸序列控制。这些序列统称为启动子。启动子通常含有用于使RNA聚合酶开始转录的信号，使得能够产生信使RNA(mRNA)。成熟的mRNA被核糖体转录，由此合成蛋白质。DNA结合蛋白与启动子DNA序列特异性相互作用以促进转录复合物的形成并启动基因表达过程。有多种从植物分离并得以表征的真核生物启动子，其对于驱动植物中的转基因表达是有功能的。已分离和表征了应答环境刺激、营养可用性、和包括热休克、厌氧生活或存在重金属在内的不利条件而影响基因表达的启动子。还有在发育期间或以组织或器官特异性方式控制基因表达的启动子。另外，已从细菌和病毒分离和表征了原核生物启动子，这些分离的原核生物启动子对于驱动植物中的转基因表达有功能。典型的能够在真核生物中表达的启动子由最小启动子和其他顺式元件组成。最小启动子实质上是一个TATA框区，RNA聚合酶II(polII)、TATA结合蛋白(TBP)和TBP相关因子(TAF)可在此结合而启动转录。然而，在大多数情况下，准确的转录需要TATA基序以外的序列元件。已发现这类序列元件(例如增强子)提高临近的基因的总体表达水平，且往往是以不依赖位置和/或取向的方式。在一些polII基因的转录起始位点附近的其他序列(例如INR序列)可以为其他促进转录活化的因子提供可变剪接位点，在缺少功能性TATA元件的启动子中，其甚至可替代地提供转录的核心启动子结合位点。Zenzie-Gregory等(1992)J.Biol.Chem.267:2823-30。其他基因调控元件包括与特定DNA结合因子相互作用的序列。这些序列基序有时称为顺式元件，且通常是位置和取向依赖性的，尽管它们可见于基因编码序列的5’或3’侧或内含子中。这类顺式元件，组织特异性或发育特异性转录因子结合的单独或组合地与它们结合，可以决定启动子在转录水平上的时空表达模式。上游顺式元件后随最小启动子的排列方式通常会产生具体启动子的极性。已克隆并广泛用于基础研究和生物技术应用的植物中的启动子一般是单向的，仅指导融合于其3’端(即下游)的一个基因。参见，Xie等(2001)Nat.Biotechnol.19(7):677-9；美国专利6,388,170。在植物启动子中已鉴定出许多顺式元件(或“上游调节序列”)。这些顺式元件施加于与其可操作连接的基因的控制有很大不同。一些元件作用于提高可操作连接的基因应答环境响应(例如温度、湿度和创伤)的转录。其他顺式元件可能对发育线索(developmentalcue)(例如萌发、种子成熟和开花)或空间信息(流例如组织特异性)应答。参见例如，Langridge等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:3219-23。特定启动子元件的控制类型通常是启动子的内在性质；即，在这类启动子控制下的异源基因很可能依照该启动子元件所来源的天然基因的控制来表达。这些元件通常还可与其他元件交换并维持其对基因表达的特征性内在调控。为了代谢工程和性状叠加的目的，经常需要将多个基因导入植物中，这些基因经常由相同的或同源的启动子调控。然而，当多个导入的转基因具有同源的启动子来驱动它们时，很可能发生基于同源性的基因沉默(HBGS)。Mol等(1989)PlantMol.Biol.13:287-94。因此，已报告HBGS在转基因植物中大量发生。参见例如，Vaucheret和Fagard(2001)TrendsGenet.17:29-35。提出了几种机制来解释HBGS现象，其均包括以下特征，即启动子中的序列同源性触发导致重复基因沉默的细胞识别机制。Matzke和Matzke(199547:23-48；Fire(1999)TrendsGenet.15:358-63；Hamilton和Baulcombe(1999)Science286:950-2；Steimer等(2000)PlantCell12:1165-78。此外，为了获得不同转基因的相似水平的表达模式而重复使用相同的启动子，可能导致重复启动子中竞争性转录因子(TF)结合位点的过量，可导致内源性TF的耗竭并导致转录下调。鉴于在转基因事件的单个基因座内强化表达多基因性状的需要越来越强烈，提供减少与创建此类转基因事件相关的技术挑战的解决方案是重要的。更具体地说，避免转基因植物中HBGS的策略经常涉及开发功能等同但具有最小序列同源性的人造启动子是理想的。当将这类人造启动子用于在作物植物中表达转基因时，它们可以有助于避免或减少HBGS。Mourrainetal.(2007)Planta225(2):365-79；Bhullaretal.(2003)PlantPhysiol.132:988-98。公开在本专利技术的实施方案中，本公开涉及包含来自拟南芥泛素-10启动子和木薯叶脉花叶病毒启动子的多个启动子元件的人造木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)双向多核苷酸启动子。在另一个实施方案中，本专利技术公开包括各种启动子元件。相应地，启动子元件包含内含子。在一些情况下，启动子元件包含5'-UTR。此外，启动子元件包含上游启动子元件。此外，启动子元件包含最小核心启动子。在本专利技术的实施方案中，本公开涉及用于产生转基因植物细胞的方法，包括以下步骤：a)用包含人造的CsVMV双向多核苷酸启动子的基因表达盒转化植物细胞，所述人造的CsVMV双向多核苷酸启动子可操作地连接于至少一个目的多核苷酸序列；b)分离包含基因表达盒的转化的植物细胞；和c)产生包含所述可操作地连接于至少一个目的多核苷酸序列的人造的CsVMV双向多核苷酸启动子的转基因植物细胞。在本专利技术公开的实施方案中，本公开涉及用于在植物细胞中表达目的多核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物细胞中引入可操作地连接于人造的CsVMV双向多核苷酸启动子的目的多核苷酸序列。在本专利技术公开的实施方案中，本公开涉及包含人造的CsVMV双向多核苷酸启动子的转基因植物细胞。从以下参考附图进行的几个实施方案的详细描述，上述和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其包含来自拟南芥泛素‑10启动子及木薯叶脉花叶病毒启动子的多个启动子元件。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.11 US 62/078,2051.一种人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其包含来自拟南芥泛素-10启动子及木薯叶脉花叶病毒启动子的多个启动子元件。2.权利要求1的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述启动子元件包括最小核心启动子。3.权利要求2的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述最小核心启动子包含与SEQIDNO:1具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。4.权利要求2的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述最小核心启动子包含与SEQIDNO:5具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。5.权利要求1的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述启动子元件包括内含子。6.权利要求5的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述内含子包含与SEQIDNO:2具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。7.权利要求1的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述启动子元件包括5'-UTR。8.权利要求7的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述5'-UTR包含与SEQIDNO:3具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。9.权利要求7的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述5'-UTR包含与SEQIDNO:6具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。10.权利要求1的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述启动子元件包括上游启动子元件。11.权利要求10的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述上游启动子元件包含与SEQIDNO:4具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。12.权利要求10的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述上游启动子元件包含与SEQIDNO:7具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。13.权利要求1的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述拟南芥泛素-10启动子包含与SEQIDNO:8具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。14.权利要求1的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述木薯叶脉花叶病毒启动子包含与SEQIDNO:9具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。15.权利要求1的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，所述人造CsVMV双向多核苷酸启动子选自SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、和SEQIDNO:13。16.权利要求1的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，该人造CsVMV双向多核苷酸启动子包含SEQIDNO:10。17.权利要求1的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，该人造CsVMV双向多核苷酸启动子包含SEQIDNO:11。18.权利要求1的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，该人造CsVMV双向多核苷酸启动子包含SEQIDNO:12。19.权利要求1的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，该人造CsVMV双向多核苷酸启动子包含SEQIDNO:13。20.权利要求15的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其包含第一目的多核苷酸序列，所述第一目的多核苷酸序列可操作地连接于该选自SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13的人造CsVMV双向多核苷酸启动子的3'末端。21.权利要求20的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其包含第二目的多核苷酸序列，所述第二目的多核苷酸序列可操作地连接于该选自SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13的人造CsVMV双向多核苷酸启动子的5'末端。22.如权利要求20或21中的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述目的多核苷酸序列包含性状。23.权利要求22的人造CsVMV双向多核苷酸启动子，其中所述性状选自杀虫剂抗性性状、除草剂耐性性状、氮利用效率性状、水分利用效率性状、营养品质性状、DNA结合性状、选择标志物性状、及其任何组合。24.一种用于产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括：a)用包含与至少一个目的多核苷酸序列可操作地连接的人造CsVMV双向多核苷酸启动子的基因表达盒转化植物细胞；b)分离包含所述基因表达盒的经转化的植物细胞；和，c)产生转基因植物细胞，其包含所述与至少一个目的多核苷酸序列可操作地连接的人造CsVMV双向多核苷酸启动子。25.权利要求24的方法，其中转化植物细胞是用植物转化方法进行的。26.权利要求25的方法，其中所述植物转化方法选自下组：土壤杆菌介导的转化法、生物射弹转化法、碳化硅转化法、原生质体转化法、和脂质体转化法。27.权利要求24的方法，其中所述目的多核苷酸序列在整个转基因植物细胞中组成型表达。28.权利要求24的方法，其中所述目的多核苷酸序列稳定整合到转基因植物细胞的基因组中。29.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·库马尔，T·齐察克，H·L·罗宾逊，D·R·帕雷迪，W·陈，
申请(专利权)人：美国陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国,US