本发明专利技术提供用于在植物细胞和/或植物组织中表达多个基因的构建体和方法。提供的构建体包含连接于多个基因表达盒的至少一个双向启动子，其中所述双向启动子包含来自甘蔗杆状病毒启动子的功能性启动子核苷酸序列。在一些实施方案中，提供的构建体和方法采用基于来自玉蜀黍泛素-1基因的最小核心启动子元件的双向启动子或其功能等同物，和来自甘蔗杆状病毒启动子的核苷酸序列元件。在一些实施方案中，提供的构建体和方法允许3至20个基因的表达。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于合成的双向SCBV植物启动子的方法和构建体优先权要求本申请要求2011年12月30日提交的美国临时专利申请流水号61/582,148的申请日的权益。本申请还要求2012年5月3日提交的美国临时专利申请流水号61/641,956的申请日的权益。专利
本申请一般涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及多个基因在转基因植物中稳定表达的领域。
本申请一般涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及多个基因在转基因植物中稳定表达的领域。专利技术背景许多植物物种可以用来自其他物种的转基因转化以引入农学上期望的性状或特征，例如改善营养价值品质、提高产率、赋予害虫或疾病抗性、提高干旱和应激耐受性、改善园艺质量(如着色和生长)、给予除草剂抗性、使得能够从植物产生工业上有用的化合物和/或材料、和/或使得能产生药物。将转基因导入到植物细胞、随后复原含有稳定整合的转基因拷贝的可育转基因植物的做法，可以用来产生拥有期望性状的转基因植物。基因表达的控制和调节的运行机制众多。基因的转录启动是基因表达的主要控制机制。转录的启动一般由位于所转录基因的5’侧翼或上游区中的多核苷酸序列控制。这些序列统称为启动子。启动子通常含有用于使RNA聚合酶开始转录的信号，使得能够产生信使RNA(mRNA)。成熟的mRNA被核糖体翻译，由此合成蛋白质。DNA结合蛋白与启动子DNA序列特异性相互作用以促进转录复合物的形成并启动基因表达过程。有多种从植物分离并得以表征的真核生物启动子，其对于驱动植物中的转基因表达是有功能的。已分离和表征了应答环境刺激、营养可用性、和包括热休克、厌氧生活或存在重金属在内的不利条件而影响基因表达的启动子。还有在发育期间或以组织或器官特异性方式控制基因表达的启动子。另外，已从细菌和病毒分离和表征了原核生物启动子，这些分离的原核生物启动子对于驱动植物中的转基因表达有功能。典型的真核生物启动子由最小启动子和其他顺式元件组成。最小启动子实质上是一个TATA框区，RNA聚合酶II(polII)、TATA结合蛋白(TBP)和TBP相关因子(TAF)可在此结合而启动转录。然而，在大多数情况下，准确的转录需要TATA基序以外的序列元件。已发现这类序列元件(例如增强子)提高临近的基因的总体表达水平，且往往是以不依赖位置和/或取向的方式。在一些polII基因的转录起始位点附近的其他序列(例如INR序列)可以为其他促进转录活化的因子提供可变剪接位点，在缺少功能性TATA元件的启动子中，其甚至可替代地提供转录的核心启动子结合位点。参见例如，Zenzie-Gregory等(1992)J.Biol.Chem.267:2823-30。其他基因调控元件包括与特定DNA结合因子相互作用的序列。这些序列基序有时称为顺式元件，且通常是位置和取向依赖性的，尽管它们可见于基因编码序列的5’或3’侧或内含子中。这类顺式元件，组织特异性或发育特异性转录因子结合的单独或组合地与它们结合，可以决定启动子在转录水平上的时空表达模式。上游顺式元件后随最小启动子的排列方式通常会产生具体启动子的极性。已克隆并广泛用于基础研究和生物技术应用的植物中的启动子一般是单向的，仅指导融合于其3’端(即下游)的一个基因。参见例如，Xie等(2001)Nat.Biotechnol.19(7):677-9；美国专利No.6,388,170。在植物启动子中已鉴定出许多顺式元件(或“上游调节序列”)。这些顺式元件施加于与其可操作连接的基因的控制有很大不同。一些元件作用于提高可操作连接的基因应答环境响应(例如温度、湿度和创伤)的转录。其他顺式元件可能对发育线索(developmentalcue)(例如萌发、种子成熟和开花)或空间信息(流例如组织特异性)应答。参见例如，Langridge等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:3219-23。特定启动子元件的控制类型通常是启动子的内在性质；即，在这类启动子控制下的异源基因很可能依照该启动子元件所来源的天然基因的控制来表达。这些元件通常还可与其他元件交换并维持其对基因表达的特征性内在调控。为了代谢工程和性状叠加的目的，经常需要将多个基因导入植物中，这些基因经常由相同的或同源的启动子调控。然而，当多个导入的转基因具有同源启动子来驱动它们时，很可能发生基于同源性的基因沉默(HBGS)。参见例如，Mol等(1989)PlantMol.Biol.13:287-94。已报告HBGS在转基因植物中大量发生。参见例如，Vaucheret和Fagard(2001)TrendsGenet.17:29-35。提出了几种机制来解释HBGS现象，其均包括以下特征，即启动子中的序列同源性触发导致重复基因沉默的细胞识别机制。参见例如，Matzke和Matzke(1995)PlantPhysiol.107:679-85；Meyer和Saedler(1996)Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.47:23-48；Fire(1999)TrendsGenet.15:358-63；Hamilton和Baulcombe(1999)Science286:950-2；和Steimer等(2000)PlantCell12:1165-78。避免转基因植物中HBGS的策略经常涉及开发功能等同但具有最小序列同源性的合成启动子。当将这类合成启动子用于在作物植物中表达转基因时，它们可以有助于避免或减少HBGS。参见例如，Mourrain等(2007)Planta225(2):365-79；Bhullar等(2003)PlantPhysiol.132:988-98。这类启动子可通过在新的或合成的DNA区段中导入已知的顺式元件，或者通过“域交换”(其中一个启动子的域被来自其他异源启动子的功能等同域替换)来生成。如此，仍然需要这样的构建体和方法，其可有效地用于多个转基因的稳定表达，且转基因植物中转基因通过育种或多个世代而发生重组或丧失的风险最小。。专利技术概述本文中描述了包含Ubi1最小启动子的特定的合成启动子。在实施方案中，包含Ubi1最小启动子的合成启动子还包含SCBV启动子的至少一个序列元件或其功能等同物。在一些例子中，这样的合成启动子(“合成的SCBV启动子”)可以是能控制可操作连接的核苷酸序列在植物细胞中转录的启动子。在其他例子中，合成的SCBV启动子可以是合成的双向SCBV启动子，例如包含最小Ubi1启动子元件核苷酸序列的核酸，该最小Ubi1启动子元件核苷酸序列相对于SCBV启动子元件取向相反，能控制位于该启动子侧翼的两个可操作连接的核苷酸序列在植物细胞中的转录。合成的SCBV双向启动子中其他可以通过工程化加入的元件包括内含子(例如醇脱氢酶(ADH)内含子)、外显子、和/或上游启动子区的全部或部分。在某些例子中，合成的双向启动子可以包含多于一个前述的任意者。本专利技术的具体实施方案包括包含合成的SCBV启动子或其功能等同物的细胞(例如植物细胞)。例如，特定的实施方案可以包括包含合成的双向SCBV启动子或其功能等同物的细胞。依照具体实施方案的植物细胞可以存在于细胞培养物、组织、植物部分和/或全植物中。因此，一些实施方案包括这样的植物(例如单子叶或双子本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种合成多核苷酸，其包含来自玉蜀黍(Zea mays)或大刍草(Zea luxurians)的泛素‑1基因的最小核心启动子元件和来自甘蔗杆状病毒启动子的功能性启动子核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.30 US 61/582,148;2012.05.03 US 61/641,9561.一种双链合成多核苷酸，包含：功能性双向启动子，其包含SEQIDNO:5；第一链，其包含与所述双向启动子可操作连接的第一目的编码核苷酸序列；和第二链，其包含与所述双向启动子可操作连接的第二目的编码核苷酸序列；其中所述第一和第二目的编码核苷酸序列相对于彼此在所述双链多核苷酸中处于反向互补的取向。2.一种用于产生转基因细胞的方法，所述方法包括用权利要求1的多核苷酸转化所述细胞。3.依照权利要求2的方法，其中所述细胞是植物细胞。4.一种用于在植物细胞和/或组织中表达多个基因的核酸构建体，包含：权利要求1的多核苷酸，其中所述第一目的编码核苷酸序列或第二目的编码核苷酸序列包含通过翻译开关连接的两个或更多个基因。5.权利要求1的双链合成多核苷酸，其中所述多核苷酸是用于土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化的双元载体。6.权利要求4的核酸构建体，其中所述第一目的编码核苷酸序列和第二目的编码核苷酸序列均包含通过翻译开关连接的两个或更多个基因。7.权利要求4的核酸构建体，其中所述翻译开关选自下组：内部核糖体进入位点(IRES)、可变剪接位点、编码2A肽的多核苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·库马，D·阿拉贝德，S·本尼特，M·格普塔，S·杰恩，T·赖特，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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