一种特异性长效siRNA及其在治疗肾纤维化中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性长效siRNA及其在治疗肾纤维化中的应用。所述特异性长效siRNA特异靶向整合素相互作用蛋白Kindlin‑2，能够有效降低肾脏Kindlin‑2蛋白的表达水平，可以有效激活肾脏中的TGFβ和Wnt信号通路，抑制Hippo信号通路，从而治疗、延缓肾纤维化的发生；进一步通过动物实验验证，UUO导致纤维化发生后给予本发明专利技术所述的特异性长效siRNA尾静脉注射可有效抑制纤维化进程，缓解纤维化程度，并且早期用药效果好。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性长效siRNA及其在治疗肾纤维化中的应用
本专利技术属于RNA干扰
，特别涉及一种特异性长效siRNA及其在治疗肾纤维化中的应用。
技术介绍
肾脏纤维化是一种病理生理改变，是肾脏的功能由健康到损伤，再到损坏，直至功能丧失的渐进过程。肾纤维化是多条信号通路参与的复杂病理过程，到目前为止没有有效的治疗手段。寻找有效的治疗靶点，达到阻断多条致病信号通路、阻断或延缓纤维化进程将是急、慢性肾病患者的福音。目前已经报道的Kindlin-2可通过激活TGF信号通路参与肾纤维化，然而，Kindlin-2对其他信号通路的调节，能否作为抑制肾纤维化的靶点，在纤维化发生后靶向治疗的效果如何并不知晓。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异性长效siRNA及其在治疗肾纤维化中的应用，所述siRNA特异靶向整合素相互作用蛋白Kindlin-2，能够有效降低肾脏Kindlin-2蛋白的表达水平，可以有效激活肾脏中的TGFβ和Wnt信号通路，抑制Hippo信号通路，从而治疗、延缓肾纤维化的发生。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种特异性长效siRNA（Kindlin-2siRNA），其序列为5′-CAGCGAGAAUCUUGGAGGC-3′。进一步的，所述siRNA经2'OMe修饰和5’Chol修饰。进一步的，所述的特异性长效siRNA可应用于制备治疗或缓解肾纤维化药物。进一步的，所述的特异性长效siRNA可应用于制备预防肾纤维化保健品、药物。一种治疗或缓解肾纤维化的药物组合物，所述药物组合物中含所述的特异性长效siRNA。进一步的，所述药物组合物为静脉注射剂。进一步的，所述特异性长效siRNA的用量为1~10nmol/20g体重，优选用量为5nmol/20g体重。本研究发现Kindlin-2与Hippo信号通路关键分子LATS1和YAP相互作用形成三分子复合物，并通过阻碍二者相互结合抑制YAPKindlin-2受YAP的负反馈调节。在临床肾纤维化患者肾组织中我们发现Hippo信号通路分子表达上调的同时，其中保护机制p-YAP的表达水平与Kindlin-2的表达呈负相关。采用长效Kindlin-2siRNA尾静脉注射治疗UUO过程中的肾纤维化形成，我们发现靶向Kindlin-2的siRNA可有效缓解肾纤维化的发生，并且越早用药效果越好。总之，我们发现Kindlin-2可调节肾纤维化过程中的三大信号通路，敲低Kindlin-2的表达可缓解肾纤维化的发生。纤维化发生后给予Kindlin-2siRNA尾静脉注射可有效抑制纤维化进程，缓解纤维化程度，并且越早用药效果越好。本专利技术相比现有技术的有益效果为：1、本专利技术揭示了敲低Kindlin-2蛋白表达缓解肾纤维化发生的具体分子机制，发现Kindlin-2可同时调节肾纤维化发生过程中的三大信号通路，激活TGFβ和Wnt信号通路，抑制Hippo信号通路；2、本专利技术所述的特异性长效siRNA，特异靶向整合素相互作用蛋白Kindlin-2，能够有效降低肾脏Kindlin-2蛋白的表达水平，可以有效激活肾脏中的TGFβ和Wnt信号通路，抑制Hippo信号通路，从而治疗、延缓肾纤维化的发生；3、通过动物实验验证，UUO导致纤维化发生后给予本专利技术所述的特异性长效siRNA尾静脉注射可有效抑制纤维化进程，缓解纤维化程度，并且早期用药效果好。附图说明图1采用FERMT2+/-型Kindlin-2敲低鼠模型(n=3)，对照以WT野生型小鼠(n=3)做UUO模型。我们发现敲低Kindlin-2表达水平可激活肾脏中的Hippo信号通路，同时抑制TGFβ和Wnt信号通路；并可以减少肾纤维化促进因素CTGF的表达；抑制肾UUO后EMT的发生；图2Kindlin-2与Hippo信号通路关键分子LATS1和YAP相互作用形成三分子复合物；图3Kindlin-2结合LATS1与YAP可抑制LATS1与YAP的结合，从而抑制LATS1对YAP的磷酸化；图4检测临床8例肾纤维化标本中Kindlin-2、MOB1、YAP和p-YAP的表达，并与正常肾组织对照；图5采用Kindlin-2siRNA,sense:5-AAGUUGGUGGAAAAACUCGAUTT-3′和ControlsiRNA,sense:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，按照A图实验设计，分5个时间点治疗UUO手术引起的肾纤维化，以第六组为对照序列做阴性对照。具体实施方式本专利技术实施例中所采用的材料：浓盐酸、浓硫酸、氢氧化钠、二甲苯、碳酸氢钠、异丙醇、三氯甲烷、丙三醇、无水乙醇、甲醇、冰醋酸、葡萄糖、无水乙酸钠、氯化钙等购自北京化工厂；对苯二酚、2-巯乙基磺酸钠、多聚甲醛、二磷酸氯喹盐、过硫酸铵、焦碳酸二乙酯(DEPC)、结晶紫、考马斯亮蓝R250、氯化镁六水合物、氯化锰、氯化钠、硼酸、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、脱氧胆酸钠、硝普钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、原钒酸钠盐、HEPES、二甲基亚砜(DMSO)、戊巴比妥钠、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、溴酚蓝、CHAPS、Tris、Tween-20、NP-40、TritonX-100、dNTP、氯霉素(Cam)等购自Sigma公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)等购自北京鼎国昌盛生物技术公司。实施例1一种特异性长效siRNA（Kindlin-2siRNA）及阴性对照siRNA：Kindlin-2siRNA,sense:5′-CAGCGAGAAUCUUGGAGGC-3′，NegativeControlsiRNA,sense:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，由广州瑞博公司合成：在Kindlin-2基因半敲除动物（FERMT2+/-）的C57小鼠和WT型C57小鼠分别做UUO模型，然后比较UUO后肾脏发生纤维化过程中Hippo信号通路、EMT指标、纤维化指标、Wnt信号通路等的变化，并且比较在Kindlin-2表达高低变化中Hippo被抑制的程度及纤维化发生的程度。WesternBlot检测1）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）①胶的制备配制所需浓度的下层分离胶，混匀后灌胶，并在胶面上小心加入蒸馏水，待胶自然凝结后将未凝的蒸馏水倾出，将配置好的5%浓缩胶倒入上层，迅速插入梳子，待凝结后小心拔出梳子，备用。②样品的制备将蛋白质样品（根据不同实验要求取合适蛋白量上样）与上样缓冲液（5×）在离心管中混合，沸水加热5min，最大转数离心10s。③电泳将配好的胶正确装入电泳槽中，倒入电泳液。用微量移液器将蛋白质样品加入样品孔底部，避免带入气泡，气泡易使样品混入到相邻的样品孔中。将电极插头与适当的电极相连。浓缩胶中电泳电压80V，当样品进入分离胶后，调节电压使之恒定在120V。染料的前沿迁移至分离胶的底部时关闭电源。④转膜SDS-PAGE结束后，从电泳槽中取出凝结玻璃板。轻轻撬开玻璃板，凝胶会贴在其中的一块玻板上。取下凝胶，放入电转缓冲液中平衡5min后进行转膜。将塑料支架平放，注意黑片（负极）在下，依次放置海绵垫、3层厚滤纸、凝胶、转印膜（PVDF膜）、3层厚滤纸、海绵垫，赶走各层间气泡，夹好支架，在冰浴中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性长效siRNA，其特征在于，所述siRNA的序列为5′‑CAGCGAGAAUCUUGGAGGC‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种特异性长效siRNA，其特征在于，所述siRNA的序列为5′-CAGCGAGAAUCUUGGAGGC-3′。2.根据权利要求1所述的特异性长效siRNA，其特征在于，所述siRNA经2'OMe修饰和5’Chol修饰。3.权利要求1或2所述的特异性长效siRNA有效降低肾脏Kindlin-2蛋白的表达量，从而激活保护性的Hippo信号通路，延缓肾纤维化的进程。4.权利要求1或2所述的特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宏权，战军，宋佳桂，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11