一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用。从化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢中提取总RNA，逆转录获得第1链cDNA，并RT‑PCR扩增克隆获得Bm.DHR cDNA；以Bm.DHR cDNA为模板PCR扩增，酶切后将DNA片段连接载体获得pFLAG‑Bm.DHR，再PCR扩增获得反应模板，将反应模板进一步处理得到Bm.DHR siRNA；将Bm.DHR siRNA液过滤膜除菌，注射入每代均产滞育卵的一化性品种家蚕化蛹后2‑3天的雌蚕蛹腹部，化蛾后正常交配，产下非滞育卵。本发明专利技术让一化性品种家蚕产非滞育卵，对于研究家蚕胚胎滞育机制、进一步利用家蚕胚胎滞育进行传统养蚕业的技术革新与经济效益提高等，具有积极作用。

SiRNA, preparation and application of a non diapause egg produced by a single strain silkworm, Bombyx mori

The invention discloses a siRNA for producing a non diapause egg of a silkworm variety, and its preparation method and application. The total RNA was extracted from the female pupa ovary of the pupae for third days in Conghua. The first chain cDNA was obtained by reverse transcriptase, and Bm.DHR cDNA was obtained by RT PCR amplification clone. The Bm.DHR cDNA was amplified by the template PCR, and the DNA fragment was connected to the pFLAG Bm.DHR, and then the reaction template was obtained. The Bm.DHR siRNA liquid filtration membrane was used to remove bacteria and injected into each generation of diapause eggs. After the silkworm pupae was pupae, the female pupa's abdomen was 2, and the moth normally copated and produced non diapause eggs. It has a positive effect on the study of the mechanism of the diapause of the Silkworm Embryo, the technological innovation of the Silkworm Embryo diapause and the improvement of the economic benefit of the traditional silkworm breeding industry.

【技术实现步骤摘要】
一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用
本专利技术涉及了一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用。
技术介绍
滞育(Diapause)是昆虫在个体发育的某个特定阶段主动停止发育的一种现象，它作为一种遗传特性，在昆虫的生存、进化、繁荣等中发挥着重要的作用。家蚕(Bombyxmori)为卵滞育型，一化性(univoltine)品种蚕每代都产滞育卵。滞育卵需要经过长时间低温处理等才能解除其滞育，这给一年多次养蚕带来不便。所以对家蚕滞育现象的研究，一直为人们所关注。蚕卵是否发生滞育，主要取决于蛹期由咽下神经节(Subpharyngealganglion，SG)合成和分泌的滞育激素(Diapausehormone，DH)作用。当合成和分泌的DH作用于卵巢和发育中蚕卵，引起多种基因表达上调，从而改变蚕卵内的物质代谢，成为滞育卵。家蚕DH的作用是通过家蚕滞育激素受体(Bm.DHR)来介导的，但有关Bm.DHR介导DH作用，来调控家蚕卵滞育等，均缺乏研究。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA，其特征在于：所述siRNA采用以下方法制备而成：1)解剖并收集化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢，从中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA；2)以第1链cDNA为模板，通过逆转录聚合酶链式反应(RT‑PCR)扩增，克隆获得Bm.DHR cDNA(家蚕滞育激素受体cDNA)；3)以Bm.DHR cDNA为模板，通过PCR扩增得到Bm.DHR DNA片段并用琼脂糖凝胶电泳回收，将Bm.DHR DNA片段用HindIII/BamHI酶切，然后将酶切片段与哺乳动物表达载体pFlag‑CMV‑3连接获得pFLAG‑Bm.DHR；4)以pFLAG‑Bm.DHR为模板，...

【技术特征摘要】
1.一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA，其特征在于：所述siRNA采用以下方法制备而成：1)解剖并收集化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢，从中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA；2)以第1链cDNA为模板，通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得Bm.DHRcDNA(家蚕滞育激素受体cDNA)；3)以Bm.DHRcDNA为模板，通过PCR扩增得到Bm.DHRDNA片段并用琼脂糖凝胶电泳回收，将Bm.DHRDNA片段用HindIII/BamHI酶切，然后将酶切片段与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3连接获得pFLAG-Bm.DHR；4)以pFLAG-Bm.DHR为模板，通过PCR扩增得到pFLAG-Bm.DHRDNA片段并用琼脂糖凝胶电泳回收，得到纯化的大小为1311bp的目的DNA片段，作为反应模板；5)将反应模板与10×T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合进行反应，然后再进行后续处理得到Bm.DHRsiRNA，作为所述siRNA。2.根据权利要求1所述的一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA制备方法，其特征在于：所述步骤1)具体为：解剖并收集化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录获得第1链cDNA，逆转录条件是：30℃变性10min，50℃反应60min，95℃灭活5min。3.根据权利要求1所述的一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA制备方法，其特征在于：所述步骤2)具体为：以第1链cDNA为模板，分别用如SEQIDNO.1的正向引物5’-ATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3’和如SEQIDNO.2的反向引物5’-TTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3’进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得Bm.DHRcDNA(家蚕滞育激素受体cDNA)。4.根据权利要求3所述的一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA制备方法，其特征在于：所述的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增条件是：94℃预变性2min，94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸80s，进行30个循环。5.根据权利要求1所述的一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，Bm.DHRDNA片段具体采用以下方式获得：以Bm.DHRcDNA为模板，分别用如SEQIDNO.3的正向引物5’-ATG...

【专利技术属性】
技术研发人员：时连根，沈张飞，蒋学，费建明，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33