一种抑制PARP基因用于治疗乳腺癌的siRNA制造技术

本发明专利技术涉及乳腺癌治疗技术领域，特别涉及利用抑制PARP基因表达的siRNA来降低PARP基因的表达水平，通过在线软件设计3对针对PARP基因的siRNA，通过Real‑time PCR、Western Blot和MTT实验分别检测PARP mRNA表达水平降低、蛋白质表达水平降低和抑制乳腺癌细胞增长，表明该siRNAs能够高效抑制PARP基因的表达，为PARP抑制剂的研发提供理论基础。

A siRNA inhibitor of PARP gene for breast cancer treatment

The present invention relates to the technical field of breast cancer treatment, especially to reduce the expression level of PARP gene by using siRNA to inhibit the expression of PARP gene. 3 pairs of siRNA for PARP gene are designed by on-line software, and the expression level and protein expression level are detected by Real time PCR, Western Blot and MTT experiment. Reducing and inhibiting breast cancer cell growth indicates that the siRNAs can inhibit the expression of PARP gene efficiently and provide a theoretical basis for the development of PARP inhibitors.

【技术实现步骤摘要】
一种抑制PARP基因用于治疗乳腺癌的siRNA
本专利技术涉及乳腺癌治疗
，特别涉及一种抑制PARP基因表达的siRNA来降低PARP基因的表达水平，达到治疗乳腺癌的目的。
技术介绍
聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）广泛存在于真核细胞中，PARP是一个超蛋白家族，迄今为止已经发现了十余种PARP，PARP的功能涉及DNA修复、细胞增殖、细胞死亡和端粒长度调节等多方面，PARP能够迅速与DNA断链结合，活性增加数百倍之多，能够通过碱基切除修复途径使受损的DNA得以修复，在DNA损伤修复中发挥着重要作用。现存很多化疗药物的目的都是通过损伤DNA杀伤肿瘤细胞，肿瘤细胞也会针对不同的化疗药物启动修复途径，对抗化疗药物会产生一定的耐药性，降低化疗药物的疗效。RNA干扰技术是一种新兴的基因治疗技术，又称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(genesilencing)，其中siRNA(smallinterferingRNA)是最关键的效应分子，其具有21-23nt碱基的短片段双链RNA分子，能够以序列特异性地结合靶mRNA并使mRNA降解。能有效、特异地抑制细胞内基因的表达。由于RNA干扰具有高效、特异性，siRNA介导的转录后基因沉默是针对靶向基因的外显子序列，对其启动子或内含子序列却没有效应，是一种转录后基因表达调控机制，且不诱导非特异性的干扰素激活途径，因而成为继反义核普酸、核酶技术之后一种新的分析功能缺失表型的工具，为基因功能研究和基因治疗开辟了新的道路。PARP抑制剂通过抑制肿瘤细胞DNA损伤修复、促进肿瘤细胞发生凋亡，从而可增强化疗药物的疗效，是一种能够影响癌细胞的自我复制方式的医学用剂。对于PARP抑制剂，医学专家们寄予了厚望，也给肿瘤患者带来希望，但我国对于PARP抑制剂的研究还落后于国际水平，故需要为PARP抑制剂提供一些理论基础，从而推动我国在此领域研发的进度。
技术实现思路
鉴于以上问题，本提供3对针对PARP基因DNA片段的siRNA，能高效的抑制PARP基因表达的小干扰核糖核酸，为研发PARP抑制剂做好理论准备。所述siRNA序列包含如下序列：siRNA1正义链：5’-CAGGCUGCUUUGUCAAGAAUU-3’反义链：3’-UUGUCCGACGAAACAGUUCUU-5’；siRNA2正义链：5’-GAGCUACUCAUCUUCAACAUU-3’反义链：3’-UUCUCGAUGAGUAGAAGUUGU-5’；siRNA3正义链：5’-CAAAGGAAUUCCGAGAAAUUU-3’反义链：3’-UUGUUUCCUUAAGGCUCUUUA-5’。本专利技术提供了一种小分子干扰核糖核酸，其包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段能形成双链RNA，该双链RNA能抑制PARP基因的表达。对于上述小分子干扰核糖核酸来说，所述正义RNA片段和反义RNA片段可以存在于两条不同的RNA链上，也可以存在于同一条RNA链上。当正义RNA片段和反义RNA片段存在于同一条RNA链上时，所述核糖核酸优选为发夹型单链RNA分子，其中正义RNA片段和反义RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。对于任一项所述的小分子干扰核糖核酸，其中双链RNA的互补区域至少有19个碱基对。本专利技术的所述抑制PARP基因表达的siRNA，通过人工合成形成，其生产和制备属于现有技术。进一步的，Real-timePCR检测mRNA表达水平。进一步的，WesternBlot实验检测蛋白质表达水平。进一步的，MTT法为实验手段检测癌细胞生长。所述的Real-timePCR实验、WesternBlot实验和MTT法中，所选择的癌细胞均为人乳腺癌细胞株T47D。本专利技术提供的siRNA能抑制PARP基因的表达，Real-timePCR检测PARPmRNA表达水平降低，WesternBlot实验检测PARP蛋白质表达水平降低，MTT法中可抑制T47D细胞的生长，该siRNAs能够高效特异地抑制PARP基因的表达。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为RT-PCR实验显示PARPsiRNA组mRNA表达量有所下降。图2为WesternBlot实验灰度值分析，转染PARPsiRNA组的PARP蛋白的表达水平相对于阴性对照组显著下降。图3为MTT实验显示可抑制T47D细胞的生长。附图标记说明Blank代表空白对照组NC代表阴性对照组PA-siR代表转染PARPsiRNA组。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。实施例1.siRNA的设计合成及转染从Genebank中调取PARP基因(NM_001618)信息，用在线设计软件设计针对PARP基因可能有效的siRNA靶点；再通过BLAST分析，将候选siRNA靶位点同人类基因序列进行同源性比对，排除同PARP基因以外的其它人类基因序列具有较高序列同源性(16个以上碱基)的序列，以确保候选siRNA靶位点不会对其它人类基因发生抑制作用，而仅对PARP基因具有特异的抑制作用。分析设计总共得到3对siRNA：siRNA1正义链：5’-CAGGCUGCUUUGUCAAGAAUU-3’反义链：3’-UUGUCCGACGAAACAGUUCUU-5’；siRNA2正义链：5’-GAGCUACUCAUCUUCAACAUU-3’反义链：3’-UUCUCGAUGAGUAGAAGUUGU-5’；siRNA3正义链：5’-CAAAGGAAUUCCGAGAAAUUU-3’反义链：3’-UUGUUUCCUUAAGGCUCUUUA-5’。选取与基因组中的任何序列都没有连续16个碱基的同源性的靶序列作为阴性对照NC，具体序列如下：正义链序列：5’-UUCUCCGAAGCUGUCACGUTT-3’反义链序列：5’-ACGUGACAGCUUCGGAGAATT-3’。所述siRNA1-3和NC序列中的A、G、C、U分别表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脱氧核苷酸。将浓度为0.6×104PM的细胞悬液接种于标准12孔细胞培养板中，以DMEM＋15％的小牛血清为培养基培养人乳腺癌细胞株T47D，转染前更换新鲜培养剂。每孔加入10pmole的siRNA和7ul的siRNA转染试剂INTERFERin™，转染方法按照转染试剂生产商的试剂说明书进行。实施例2.细胞总RNA的提取实验分三组进行：空白对照组（Blank），随机对照组（Negativecontrol,NC），PARPsiRNA（PA-siR）组。a.用PBS溶液洗涤细胞，去上清，去除培养基；b.培养皿中加入1mlTrizol，用枪头吹打混匀，细胞完全裂解后转移至1.5ml离心管中。加入200μL氯仿，剧烈震荡混匀后常温放置15min；c.4℃，本文档来自技高网...

【技术保护点】
抑制PARP基因表达的siRNA，所述 siRNA 序列包含如下序列：siRNA1 正义链 ：5’‑ CAGGCUGCUUUGUCAAGAAUU‑3’反义链 ：3’‑ UUGUCCGACGAAACAGUUCUU‑5’；siRNA2 正义链 ：5’‑ GAGCUACUCAUCUUCAACAUU‑3’反义链 ：3’‑ UUCUCGAUGAGUAGAAGUUGU‑5’；siRNA3 正义链 ：5’‑ CAAAGGAAUUCCGAGAAAUUU‑3’反义链 ：3’‑ UUGUUUCCUUAAGGCUCUUUA‑5’。

【技术特征摘要】
1.抑制PARP基因表达的siRNA，所述siRNA序列包含如下序列：siRNA1正义链：5’-CAGGCUGCUUUGUCAAGAAUU-3’反义链：3’-UUGUCCGACGAAACAGUUCUU-5’；siRNA2正义链：5’-GAGCUACUCAUCUUCAACAUU-3’反义链：3’-UUCUCGAUGAGUAGAAGUUGU-5’；siRNA3正义链：5’-CAAAGGAAUUCCGAGAAAUUU-3’反义链：3’-UUGUUUCCUUAAGGCUCUUUA-5’。2.如权利要求1所述的抑制PARP基因表达的siRNA在用于制备治疗癌症的药物中的用途。3.权利要求2所述的用途，其特征在于，所述癌症为卵巢癌和乳腺癌。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：李风玲，柳一平，卓南，毛帮成，季晓，
申请(专利权)人：李风玲，
类型：发明
国别省市：山西,14