长牡蛎IgSF分子CgCAICP1基因重组蛋白、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开一种长牡蛎IgSF分子

IgSF protein CgCAICP1 gene recombinant protein of oyster Crassostrea gigas, preparation method and Application

The invention discloses a IgSF molecule of long oysters

【技术实现步骤摘要】
长牡蛎IgSF分子CgCAICP1基因重组蛋白、制备方法及应用
本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种长牡蛎IgSF分子CgCAICP1基因重组蛋白、制备方法及应用。
技术介绍
免疫球蛋白超家族IgSF分子，主要由B淋巴细胞产生，是脊椎动物适应性免疫（adaptiveimmunity）的重要组成成分，能通过一系列分子机制产生多种多样的抗原结合表位，并与对应的抗原决定簇特异性结合。尽管无脊椎动物不具备脊椎动物中基于抗体的适应性免疫系统，但是其对于病原入侵仍能够形成有效的免疫应答。研究发现，IgSF分子行使功能的主要方式包括以下四种类型：a.模式识别；b.微生物凝集作用；c.吞噬调理作用；d.细胞凝集和抗凝集作用。如昆虫中的hemolin能够与LPS上的两个结合位点结合并且能够凝集多种微生物；文昌鱼中的VCBP和甲壳动物中的DSCAM也都能够识别并结合大量配体；中国明对虾FcLec4与血淋巴细胞表面的β-integrin结合并起到调理作用。但是，迄今为止并没有关于长牡蛎IgSF分子CgCAICP1基因重组蛋白、制备方法及在制备抑制革兰氏阴性菌药物中应用的相关报道。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种长牡蛎IgSF分子CgCAICP1基因重组蛋白、制备方法及应用。本专利技术的技术解决方案是：一种长牡蛎IgSF分子CgCAICP1基因重组蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。上述长牡蛎IgSF分子CgCAICP1基因重组蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.用特定引物P1和P2对长牡蛎IgSF分子CgCAICP1编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQIDNO.2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQIDNO.3所示；b.将PCR扩增产物与pET32a载体经NcoI和HindⅢ酶切后通过T4连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；c.将上述重组子转入大肠杆菌Transetta（DE3）表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，即得到具有序列表SEQIDNO.1中氨基酸序列的重组蛋白。上述长牡蛎IgSF分子CgCAICP1基因重组蛋白在制备抑制革兰氏阴性菌药物中的应用。本专利技术中的长牡蛎IgSF分子CgCAICP1基因重组蛋白克隆自长牡蛎cDNA文库，具有多种微生物的结合活性并且能够显著提高长牡蛎血淋巴细胞对于革兰氏阴性菌的吞噬率，作为一种有效的模式识别受体，在制备抗菌类药物、新型免疫制剂以及饲料添加剂等方面具有应用价值。附图说明图1是本专利技术实施例IgSF分子CgCAICP1基因重组蛋白的菌结合活性检测图。图2是本专利技术实施例IgSF分子CgCAICP1基因重组蛋白促吞噬作用检测效果图。具体实施方式本专利技术的上述长牡蛎IgSF分子CgCAICP1基因重组蛋白的制备方法，依次按照如下步骤进行：1.重组载体的构建本专利技术实施例采用的重组载体为Novagen公司的pET-32a(+)原核表达载体。通过PCR技术，采用5’末端分别添加了NcoI和Hind限制性酶切位点的引物P1和P2扩增来自长牡蛎CgCAICP1mRNA的编码区。所述引物P1的DNA序列如SEQIDNO.2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQIDNO.3所示。PCR反应条件为：首先94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸2min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。用琼脂糖胶电泳将扩增片段纯化回收，与pMD19-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒，并使用NcoI和Hind对质粒进行双酶切；回收目的片段，并经NcoI和Hind酶切的表达载体pET-32a(+)连接，完成重组质粒的构建。2.重组蛋白rCgCAICP1的表达将构建好的重组质粒转化表达宿主菌大肠杆菌Transetta(DE3)中，挑取单克隆，接种于200ml的LB液体培养基中，220rpm，37℃培养至OD600=0.4~0.8。加入IPTG（终浓度1mmolL-1），继续培养4小时后于4℃10000rpm离心5min，收集菌体，于-80℃冻存备用；同时取1ml菌液离心，弃去上清后，加入80μl水和20μl的5×蛋白上样缓冲液，99℃煮沸10min，稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。3.重组蛋白rCgCAICP1的纯化与复性重组蛋白采用镍琼脂糖凝胶FF柱纯化，获得了变性重组蛋白，用透析缓冲液透析复性。具体操作步骤如下：（1）镍琼脂糖凝胶FF装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；（2）用缓冲液I（50mmolL-1Tris-Hcl缓冲液，pH=7.4,50mmolL-1NaCl,8molL-1尿素）平衡2~5个床体积，流速为2mlmin-1；（3）取经IPTG诱导表达的细胞，用缓冲液I重悬，150W超声破碎30min，12000rmp，4℃离心30min，上清液用0.45μm滤膜过滤后，过柱，流速为1mlmin-1；（4）用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2mlmin-1；（5）用有50mmolL-1咪唑的缓冲液I再洗2~5个柱床体积，流速为2mlmin-1；（6）用400mmolL-1咪唑的缓冲液I洗脱目的蛋白，收集;（7）用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达；（8）用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2mlmin-1，柱子置于4℃环境中保存变性状态下提纯的重组蛋白需要在复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。变性纯化产物经2mM的还原谷胱甘肽、0.4mM氧化谷胱甘肽、1mMEDTA、50mMTris-HCl、100mMNaCl、10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始的6M逐渐替换到4M、3M、2M、1M、0M，最后一次透析至无尿素的透析液时不加甘油，每次在4℃透析12h。即得到长牡蛎CgCAICP1基因重组蛋白（rCgCAICP1）。所得到的长牡蛎CgCAICP1基因重组蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。长度：574个氨基酸类型：氨基酸链型：单链特性：分子量为63.4kDa，等电点为5.91，具有一个半胱氨酸富含区域和三个免疫球蛋白结构域。实验例1：长牡蛎重组蛋白rCgCAICP1菌结合活性检测基于westernblotting方法检测重组蛋白对两种革兰氏阴性菌（灿烂弧菌和大肠杆菌），两种革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌）以及一种真菌毕赤酵母的结合活性。所用菌种来源如下：灿烂弧菌（VibriosplendidusJZ6）购自北京微生物菌种保藏中心，大肠杆菌（Escherichiacoli）购自北京全式金公司，金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）购自北京微生物菌种保藏中心，藤黄微球菌（Micrococcusluteus）购自北京微生物菌种保藏中心，毕赤酵母菌（PichiapastorisGS115）购自Invitrogen公司。具体操作如下：（1）对上述5种微生物进行过夜培养，培养方法：藤黄微球菌和大肠杆菌于LB培养基37°C培养20小时，金黄色葡萄球菌于LB培养基28°C培养20小时，灿烂弧菌于2216E培养基中28°C培养20小时，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长牡蛎IgSF分子

【技术特征摘要】
1.一种长牡蛎IgSF分子CgCAICP1基因重组蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种如权利要求1所述长牡蛎IgSF分子CgCAICP1基因重组蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.用特定引物P1和P2对长牡蛎IgSF分子CgCAICP1编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQIDNO.2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋林生，刘冬杨，衣启麟，宋小瑞，王玲玲，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21