同时检测七种水仙RNA病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了同时检测七种水仙RNA病毒的多重RT‑PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明专利技术的试剂盒可专用于同时检测水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒，该试剂盒包括多重RT‑PCR特异性引物、随机引物、RT Buffer、RNA酶抑制因子、反转录酶、Taq PCR Mix、阳性及阴性对照品。通过实验证明：本发明专利技术的特异性引物不仅具有特异性好、灵敏度高、高通量和结果准确的优点，而且检测方法操作简便，无需克隆、测序和序列比对的步骤，显著提高了检测效率，节约了检测时间和成本，可以有效用于七种水仙RNA病毒的快速、准确鉴定，应用前景广泛。

Multiplex RT-PCR detection kit for simultaneous detection of seven Narcissus RNA viruses and its detection methods

The invention discloses a multiplex RT PCR detection kit for simultaneous detection of seven Narcissus RNA viruses and a detection method thereof. The kit can be used for the simultaneous detection of Narcissus yellow strip virus, Narcissus degenerate virus, Narcissus latent virus, cauliflower virus, Narcissus common latent virus, Narcissus leaf virus and nil latent virus. The kit includes multiple RT PCR specific primers, random primers, RT Buffer and RNA enzyme inhibitors. Reverse transcriptase, Taq PCR Mix, positive and negative controls. It is proved by experiments that the specific primers not only have the advantages of good specificity, high sensitivity, high throughput and accurate results, but also the detection method is easy to operate, without the need of cloning, sequencing and sequence alignment, which significantly improves detection efficiency, saves detection time and costs, and can be effectively used in seven kinds of water. The fast and accurate identification of immortal RNA virus has wide application prospects.

【技术实现步骤摘要】
同时检测七种水仙RNA病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及同时检测七种水仙RNA病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫
，适用于进出境口岸检疫和农业生产上水仙主要RNA病毒的快速检测。
技术介绍
水仙(NarcissustazettaL.)属于石蒜科(Amaryllidaceae)水仙属(Narcissus)多年生草本植物，是世界著名的观赏球根花卉。水仙作为我国传统出口名花，同时也是福建省省花，在我国花卉生产中占据着十分重要的地位。病毒病是水仙上的主要病害，引起种球变小、花箭减小、香气变淡、鳞茎退化和植株矮化等一系列症状，造成水仙的产量和品质严重下降。目前，国内外已报道可侵染水仙的主要RNA病毒包括水仙黄条病毒(Narcissusyellowstripevirus，NYSV)、水仙退化病毒(Narcissusdegenerationvirus，NDV)、水仙潜隐病毒(Narcissuslatentvirus，NLV)、南芥菜花叶病毒(Arabismosaicvirus，ArMV)、水仙普通潜隐病毒(Narcissuscommonlatentvirus，NCLV)、水仙花叶病毒(Narcissusmosaicvirus，NMV)和尼润潜隐病毒(Nerinelatentvirus，NeLV)。由于水仙绝大多数以无性方式繁殖，一旦种球带毒，病毒将在种球内不断积累，导致种球退化，并通过子代进一步传播和扩散，成为远距离和大范围传播的重要途径。水仙病毒病的防治极其困难，至今尚无完全有效的方法。加强病毒的早期检测，及时采取防控措施，仍是预防与控制水仙病毒病的重要手段。目前已报道的水仙病毒检测方法包括生物学测定、电镜观察、血清学检测和分子生物学检测方法四种，主要是针对单个病毒或2-3个病毒进行检测，无法对水仙上需要关注的七种主要RNA病毒(水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒)进行一次性同时检测。建立用于水仙上七种主要RNA病毒的高通量分子生物学检测方法，将极大地提高检测效率，节约检测成本。关于同时检测水仙上七种主要RNA病毒水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒的方法至今尚未见报道，更未见专门的七重RT-PCR检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何同时检测如下七种水仙RNA病毒：水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和/或尼润潜隐病毒。为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于鉴定七种水仙RNA病毒的成套引物对。本专利技术提供的用于鉴定七种水仙RNA病毒的成套引物对由用于鉴定水仙黄条病毒的特异引物对A、用于鉴定水仙退化病毒的特异引物对B、用于鉴定水仙潜隐病毒的特异引物对C、用于鉴定南芥菜花叶病毒的特异引物对D、用于鉴定水仙普通潜隐病毒的特异引物对E、用于鉴定水仙花叶病毒的特异引物对F和用于鉴定尼润潜隐病毒的特异引物对G组成；所述特异引物对A由引物NYSV-F和引物NYSV-R组成；所述特异引物对B由引物NDV-F和引物NDV-R组成；所述特异引物对C由引物NLV-F和引物NLV-R组成；所述特异引物对D由引物ArMV-F和引物ArMV-R组成。所述特异引物对E由引物NCLV-F和引物NCLV-R组成；所述特异引物对F由引物NMV-F和引物NMV-R组成；所述特异引物对G由引物NeLV-F和引物NeLV-R组成；所述引物NYSV-F为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NYSV-R为如下a3)或a4)：a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NDV-F为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NDV-R为如下b3)或b4)：b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NLV-F为如下c1)或c2)：c1)序列表中序列5所示的单链DNA分子；c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NLV-R为如下c3)或c4)：c3)序列表中序列6所示的单链DNA分子；c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物ArMV-F为如下d1)或d2)：d1)序列表中序列7所示的单链DNA分子；d2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物ArMV-R为如下d3)或d4)：d3)序列表中序列8所示的单链DNA分子；d4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NCLV-F为如下e1)或e2)：e1)序列表中序列9所示的单链DNA分子；e2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NCLV-R为如下e3)或e4)：e3)序列表中序列10所示的单链DNA分子；e4)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NMV-F为如下f1)或f2)：f1)序列表中序列11所示的单链DNA分子；f2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NMV-R为如下f3)或f4)：f3)序列表中序列12所示的单链DNA分子；f4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NeLV-F为如下g1)或g2)：g1)序列表中序列13所示的单链DNA分子；g2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NeLV-R为如下b3)或b4)：g3)序列表中序列14所示的单链DNA分子；g4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述七种水仙RNA病毒为水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和/或尼润潜隐病毒。上述成套引物对中，所述引物NYSV-F、所述引物NYSV-R、所述引物NDV-F、所述引物NDV-R、所述引物NLV-F、所述引物NLV-R、所述引物ArMV-F、所述引物ArMV-R、所述引物NCLV-F、所述引物NCLV-R、所述引物NMV-F、所述引物NMV-R、所述引物NeLV-F和所述引物N本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定七种水仙RNA病毒的成套引物对，由用于鉴定水仙黄条病毒的特异引物对A、用于鉴定水仙退化病毒的特异引物对B、用于鉴定水仙潜隐病毒的特异引物对C、用于鉴定南芥菜花叶病毒的特异引物对D、用于鉴定水仙普通潜隐病毒的特异引物对E、用于鉴定水仙花叶病毒的特异引物对F和用于鉴定尼润潜隐病毒的特异引物对G组成；所述特异引物对A由引物NYSV‑F和引物NYSV‑R组成；所述特异引物对B由引物NDV‑F和引物NDV‑R组成；所述特异引物对C由引物NLV‑F和引物NLV‑R组成；所述特异引物对D由引物ArMV‑F和引物ArMV‑R组成；所述特异引物对E由引物NCLV‑F和引物NCLV‑R组成；所述特异引物对F由引物NMV‑F和引物NMV‑R组成；所述特异引物对G由引物NeLV‑F和引物NeLV‑R组成。所述引物NYSV‑F为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NYSV‑R为如下a3)或a4)：a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NDV‑F为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NDV‑R为如下b3)或b4)：b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NLV‑F为如下c1)或c2)：c1)序列表中序列5所示的单链DNA分子；c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NLV‑R为如下c3)或c4)：c3)序列表中序列6所示的单链DNA分子；c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物ArMV‑F为如下d1)或d2)：d1)序列表中序列7所示的单链DNA分子；d2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物ArMV‑R为如下d3)或d4)：d3)序列表中序列8所示的单链DNA分子；d4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NCLV‑F为如下e1)或e2)：e1)序列表中序列9所示的单链DNA分子；e2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NCLV‑R为如下e3)或e4)：e3)序列表中序列10所示的单链DNA分子；e4)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NMV‑F为如下f1)或f2)：f1)序列表中序列11所示的单链DNA分子；f2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NMV‑R为如下f3)或f4)：f3)序列表中序列12所示的单链DNA分子；f4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NeLV‑F为如下g1)或g2)：g1)序列表中序列13所示的单链DNA分子；g2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NeLV‑R为如下b3)或b4)：g3)序列表中序列14所示的单链DNA分子；g4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述七种水仙RNA病毒为水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和/或尼润潜隐病毒。...

【技术特征摘要】
1.用于鉴定七种水仙RNA病毒的成套引物对，由用于鉴定水仙黄条病毒的特异引物对A、用于鉴定水仙退化病毒的特异引物对B、用于鉴定水仙潜隐病毒的特异引物对C、用于鉴定南芥菜花叶病毒的特异引物对D、用于鉴定水仙普通潜隐病毒的特异引物对E、用于鉴定水仙花叶病毒的特异引物对F和用于鉴定尼润潜隐病毒的特异引物对G组成；所述特异引物对A由引物NYSV-F和引物NYSV-R组成；所述特异引物对B由引物NDV-F和引物NDV-R组成；所述特异引物对C由引物NLV-F和引物NLV-R组成；所述特异引物对D由引物ArMV-F和引物ArMV-R组成；所述特异引物对E由引物NCLV-F和引物NCLV-R组成；所述特异引物对F由引物NMV-F和引物NMV-R组成；所述特异引物对G由引物NeLV-F和引物NeLV-R组成。所述引物NYSV-F为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NYSV-R为如下a3)或a4)：a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NDV-F为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NDV-R为如下b3)或b4)：b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NLV-F为如下c1)或c2)：c1)序列表中序列5所示的单链DNA分子；c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NLV-R为如下c3)或c4)：c3)序列表中序列6所示的单链DNA分子；c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物ArMV-F为如下d1)或d2)：d1)序列表中序列7所示的单链DNA分子；d2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物ArMV-R为如下d3)或d4)：d3)序列表中序列8所示的单链DNA分子；d4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NCLV-F为如下e1)或e2)：e1)序列表中序列9所示的单链DNA分子；e2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NCLV-R为如下e3)或e4)：e3)序列表中序列10所示的单链DNA分子；e4)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NMV-F为如下f1)或f2)：f1)序列表中序列11所示的单链DNA分子；f2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NMV-R为如下f3)或f4)：f3)序列表中序列12所示的单链DNA分子；f4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NeLV-F为如下g1)或g2)：g1)序列表中序列13所示的单链DNA分子；g2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物NeLV-R为如下b3)或b4)：g3)序列表中序列14所示的单链DNA分子；g4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述七种水仙RNA病毒为水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和/或尼润潜隐病毒。2.如权利要求1所述的成套引物对，其特征在于：所述引物NYSV-F、所述引物NYSV-R、所述引物NDV-F、所述引物NDV-R、所述引物NLV-F、所述引物NLV-R、所述引物ArMV-F、所述引物ArMV-R、所述引物NCLV-F、所述引物NCLV-R、所述引物NMV-F、所述引物NMV-R、所述引物NeLV-F和所述引物NeLV-R的摩尔比为1:1:1:1:1:1:4:4:2:2:2:2:4:4。3.权利要求1或2所述的成套引物对在如下h1)-h8)中任一所述的应用：h1)制备用于鉴定七种水仙RNA病毒的产品；h2)鉴定七种水仙RNA病毒；h3)制备用于鉴定待测病毒是否为七种水仙RNA病毒的产品；h4)鉴定待测病毒是否为七种水仙RNA病毒；h5)制备用于鉴别七种水仙RNA病毒的产品；h6)鉴别七种水仙RNA病毒；h7)制备用于检测待测样品中是否含有七种水仙RNA病毒的产品；h8)检测待测样品中是否含有七种水仙RNA病毒；所述七种水仙RNA病毒为水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和/或尼润潜隐病毒。4.含有权利要求1或2所述成套引物对的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下i1)-i4)中任一种：i1)鉴定七种水仙RNA病毒中1-7种；i2)鉴定待测病毒是否为七种水仙RNA病毒；i3)鉴别七种水仙RNA病毒；i4)检测待测样品中是否含有七种水仙RNA病毒；所述七种水仙RNA病毒为水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和/或尼润潜隐病毒。5.权利要求4所述试剂盒的制备方法，为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：(Ⅰ)权利要求1或2所述的成套引物对中各引物对的各条引物分别单独包装；(Ⅱ)权利要求1或2所述的成套引物对中各引物对的各条引物按比例混合在一起。6.一种鉴定待测病毒是否为七种水仙RNA病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建国，高芳銮，陈细红，廖富荣，何逸鹏，
申请(专利权)人：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：福建,35