一种永生化人脂肪间充质干细胞系及其建立方法技术

本发明专利技术公开了一种永生化人脂肪间充质干细胞系及其建立方法，包括以下步骤：重组慢病毒载体的构建；病毒包装；病毒收集；病毒感染间充质细胞；对感染了病毒的人脂肪间充质干细胞进行抗性筛选；将筛选出的细胞进行永生化及生物学鉴定，从而利用慢病毒作为载体，将人端粒酶逆转录酶hTERT基因整合至人脂肪间充质干细胞的基因组中，整合效率高，过程简单易于操作，减少对细胞本身基因组的影响，并且充分利用自身脂肪组织间充质干细胞，实现脂肪间充质干细胞的再利用。

【技术实现步骤摘要】
一种永生化人脂肪间充质干细胞系及其建立方法
本专利技术涉及细胞工程
，具体涉及到一种永生化人脂肪间充质干细胞系及其建立方法。
技术介绍
间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSC)最初是在骨髓中发现的，随后发现存在于人体发生发育过程中的许多组织中。目前，我们能够从骨髓、脂肪、骨骼、肌肉等组织及羊水、脐带血、脐带中分离和制备间充质干细胞。间充质干细胞具有多向分化潜能，可以分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、胰岛细胞等，并且主动归巢、免疫源性较低，具有免疫调节作用，还能够分泌多种细胞因子。细胞回输后，间充质干细胞能主动归巢到身体受损伤的部位对组织器官进行修复，如修复损伤的心肌细胞、肝脏细胞、胰岛细胞等。同时间充质干细胞与移植细胞联合使用，能通过免疫调节作用提高移植成功的可能性。其培养上清液因富含多种细胞因子及有效成分，也可以辅助伤口愈合或者疾病的治疗。因此其在临床上及医美行业具有广阔的应用前景。目前临床上使用的间充质干细胞主要是脐带来源或者骨髓来源，但是骨髓来源的间充质干细胞来源有限，不易获取，增殖能力受供体年龄和健康状况的影响；脐带来源的间充干细胞虽然弥补了骨髓来源间充质干细胞的不足，但是两者多是异体来源，有引入外源致病微生物的危险，如HIV病毒、肝炎病毒等，并且间充质干细胞传代次数有限，一般体外传十几代就开始生长缓慢，形态异常，直至静息生长，而且分离培养比较繁琐，所以实现间充质干细胞的永生化具有非常重要的意义。众所周知，端粒是是位于染色体末端一段特殊的结构，由TTAGGG的重复序列组成，具有保护染色体末端的完整性及防止染色体末端之间的融合等重要作用。正常情况下随着染色体DNA的复制，即细胞的分裂传代增值，端粒会变的越来越短，直到染色体DNA被暴露，细胞分裂停止及生物学上的复制衰老。但是在胚胎干细胞及癌细胞中端粒的长度保持不变或者变化不明显，所以它们能够无限传代，进一步研究表明端粒的长度与端粒酶的活性有密切的关系，在胚胎干细胞及癌细胞中都具有较高的端粒酶活性，而在成体细胞中几乎没有端粒酶的活性，部分成体干细胞中有较低的端粒酶活性。活性端粒酶由三部分组成：端粒酶RNA(telomeraseRNA,TR),端粒酶相关蛋白(telomerase-associatedprotein,TAP)和端粒酶逆转录酶hTERT或称端粒酶催化亚基(telomerasecatalyticsubunit,TCS)，端粒酶逆转录酶hTERT是端粒酶的一种核心亚基蛋白，其表达量的高低对端粒酶活性起决定性的作用。有研究指出在一些病毒引发的肿瘤中细胞通过表达TERT抑制细胞的死亡，而且抑制TERT的表达能够提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感度，更容易被杀死。因此，如果将端粒酶基因整合至间充质干细胞的基因组中，则有望实现间充质干细胞的永生化。目前，越来越多的人选择做吸脂术，废弃的脂肪成为间充质干细胞的重要来源，实现废物再利用。利用患者自身的细胞进行相关疾病的治疗更提高了安全性，而且也可以利用自身的间充质干细胞制作私属定制的美容抗衰老产品。脂肪间充质干细胞永生化技术为间充质干细胞的无限可能提供了技术支持。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种永生化人脂肪间充质干细胞系及其建立方法，从而克服间充质干细胞的来源及传代次数有限和容易引入外源微生物的缺陷，利用慢病毒作为载体，将人端粒酶逆转录酶hTERT基因整合至人脂肪间充质干细胞的基因组中，整合效率高，过程简单易于操作，减少对细胞本身基因组的影响，并且充分利用自身脂肪组织间充质干细胞，实现脂肪间充质干细胞的再利用。为实现上述目的，本专利技术提供了一种永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法，包括步骤：1)重组慢病毒载体的构建：构建携带人端粒酶逆转录酶hTERT基因的重组慢病毒载体；2)病毒包装：将包含病毒包装质粒以及重组慢病毒载体的转染混合物转染239T细胞；所述293T细胞是由293细胞派生，表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系，被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白，或是用以包装病毒；3)病毒收集：收集步骤2)经过转染后的239T细胞所分泌的病毒；4)病毒感染间充质细胞：将步骤3)收集的病毒感染人脂肪间充质干细胞；5)对步骤4)感染了病毒的人脂肪间充质干细胞进行抗性筛选；6)将通过步骤5)筛选出的细胞进行永生化及生物学鉴定。上述永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法在另一种实施方式中，步骤1)中，重组慢病毒载体的构建包括如下步骤：(1)从供体质粒pBABE-hygro-hTERT中酶切hTERT基因，具体地，酶切1-3μg供体质粒，然后通过琼脂糖凝胶电泳条带观察酶切下来的hTERT基因条带大小是否正确，hTERT基因条带约3400bp，胶回收酶切下来的hTERT基因；(2)对载体质粒pLX302进行酶切，具体地，酶切2-4μg载体质粒，电泳观察载体骨架大小是否正确，避免质粒污染，胶回收酶切完成的载体质粒；(3)把步骤(1)中从供体质粒中酶切下来的hTERT基因通过DNA连接酶连接至酶切完成的载体质粒，转化感受态细胞(TRAN，CD501)，获得阳性克隆，菌液PCR再次挑选阳性克隆，将最后选取的阳性克隆测序验证hTERT基因已经成功连接到载体上；(4)将抗性基因-杀稻瘟菌素(blasticidin)基因连接至上述载体上，其中hTERT基因和杀稻瘟菌素基因需要连接在不同位点上，由不同的启动子启动。上述永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法在另一种实施方式中，步骤2)中，所述293T细胞以1.9×105-2.5×105个/ml的细胞密度生长在6孔板中，待293T细胞融合度为80-90％时，开始准备转染混合物，所述转染混合物的制备及转染过程包括：(1)准备病毒包装质粒：pLX302载体质粒，pCMV-VSVG载体质粒和psPAX2载体质粒；(2)将400-600ng重组慢病毒载体溶解在20-40ul无血清细胞培养基中；(3)将2-3ul转染试剂溶解在20-40ul无血清细胞培养基中，待所述转染试剂在无血清细胞培养基中孵育3-7min后将400-600ngpLX302载体质粒，40-60ngpCMV-VSVG载体质粒、300-600ngpsPAX2载体质粒以及步骤(2)中溶解在无血清细胞培养基中的重组慢病毒载体加入到转染试剂中以组成转染混合物，室温放置15-25min后，将所述转染混合物全部加入到每孔已经铺好的293T细胞中，震荡使均匀。上述永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法在另一种实施方式中，病毒收集包括如下步骤：(1)培养经过转染后的239T细胞4-8小时后用含8-12％胎牛血清的细胞培养基换液,转染22-26小时后再次换液；(2)分别在转染62-66小时和70-74小时时收集病毒；(3)使用病毒检测卡测病毒滴度，所述病毒滴度在72小时能够达到1.5×106-2.5×106。上述永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法在另一种实施方式中，所述人脂肪间充质干细胞的获取包括如下步骤：(1)将人通过抽脂术废弃的脂肪组织使用加入双抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：重组慢病毒载体的构建：构建携带人端粒酶逆转录酶hTERT基因的重组慢病毒载体；病毒包装：将包含病毒包装质粒以及重组慢病毒载体的转染混合物转染239T细胞；病毒收集：收集经过转染后的239T细胞所分泌的病毒；病毒感染间充质细胞：将收集的病毒感染人脂肪间充质干细胞；对感染了病毒的人脂肪间充质干细胞进行抗性筛选；将筛选出的细胞进行永生化及生物学鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：重组慢病毒载体的构建：构建携带人端粒酶逆转录酶hTERT基因的重组慢病毒载体；病毒包装：将包含病毒包装质粒以及重组慢病毒载体的转染混合物转染239T细胞；病毒收集：收集经过转染后的239T细胞所分泌的病毒；病毒感染间充质细胞：将收集的病毒感染人脂肪间充质干细胞；对感染了病毒的人脂肪间充质干细胞进行抗性筛选；将筛选出的细胞进行永生化及生物学鉴定。2.根据权利要求1所述的永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法，其特征在于，重组慢病毒载体的构建包括如下步骤：从供体质粒pBABE-hygro-hTERT中酶切hTERT基因；对载体质粒pLX302进行酶切；把从供体质粒中酶切下来的hTERT基因通过DNA连接酶连接至酶切完成的载体质粒构建成为重组慢病毒载体，并进一步连接杀稻瘟菌素基因。3.根据权利要求1所述的永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法，其特征在于，所述293T细胞以1.9×105-2.5×105个/ml的细胞密度生长在6孔板中，待293T细胞融合度为80-90％时，开始准备转染混合物，所述转染混合物的制备及转染过程包括以下步骤：准备病毒包装质粒：pLX302载体质粒，pCMV-VSVG载体质粒和psPAX2载体质粒；将400-600ng重组慢病毒载体溶解在20-40ul无血清细胞培养基中；将2-3ul转染试剂溶解在20-40ul无血清细胞培养基中，待所述转染试剂在无血清细胞培养基中孵育3-7min后，将400-600ngpLX302载体质粒，40-60ngpCMV-VSVG载体质粒、300-600ngpsPAX2载体质粒以及溶解在无血清细胞培养基中的重组慢病毒载体加入到转染试剂中以组成转染混合物，室温放置15-25min后，将所述转染混合物全部加入到每孔已经铺好的293T细胞中，震荡使均匀。4.根据权利要求1所述的永生化人脂肪间充质干细胞系的建立方法，其特征在于，病毒收集包括以下步骤：培养经过转染后的239T细胞4-8小时后用含8-12％胎牛血清的细胞培养基换液，转染22-26小时后再次换液；分别在转染62-66小时和70-74小时时收集病毒；使用病毒检测卡测病毒滴度，所述病毒滴度在72小时能够达到1.5×106-2.5×106。5.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐珊珊，穆小生，董飞，孟二红，李香群，盖丽云，李刚毅，
申请(专利权)人：北京多赢时代科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11