GLP‑1(7‑37)多肽类似物制造技术

本发明专利技术涉及一种新的GLP‑1(7‑37)类似物，所述GLP‑1(7‑37)类似物具有突变A8S和V33R。多肽类似物经改良后，具有更高的生物活性及更长的生物半衰期。本发明专利技术还涉及包含所述的新的GLP‑1(7‑37)类似物的脂肪酸修饰物及其在治疗糖尿病中的运用。

GLP 1 (7 37) peptide analogs

【技术实现步骤摘要】
GLP-1(7-37)多肽类似物
本专利技术涉及二型糖尿病的治疗。更具体而言，本专利技术涉及GLP-1(7-37)多肽类似物及所述多肽类似物的脂肪酸修饰物，这些修饰物的制备方法，及含这些修饰物在降血糖药物中的用途。
技术介绍
糖尿病是一种由遗传和环境等多种因素引起的糖代谢紊乱疾病，现已成为继肿瘤、心脑血管疾病之后威胁人类健康和生命安全的第三位重大疾病。糖尿病本身不一定造成危害，但长期血糖增高，大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等，据世界卫生组织统计，糖尿病并发症高达100多种，是目前已知并发症最多的一种疾病。因糖尿病死亡者有一半以上是心脑血管所致，10％是肾病变所致。因糖尿病截肢是非糖尿病的10～20倍。为此治疗糖尿病进而预防其并发症是至关重要的社会问题。糖尿病由于患病机理不同可分为几种类型。其中绝大部分属于二型糖尿病(约90％)，主要是因体重过重和缺乏身体活动所致。II型糖尿病患者多存在胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足两方面异常，在发病的中晚期往往出现胰岛β细胞凋亡。目前，临床使用的口服降糖药的作用机理多为增强胰岛素敏感性，或促进胰岛素分泌以稳定血糖，均无法解决β细胞凋亡这一难题。而GLP-1及其类似物药物由于具有减缓β细胞凋亡，增进其再生，促使胰岛β细胞分化并增殖的作用，使其成为治疗II型糖尿病的研究重点。GLP-1是已发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素，它通过与GLP-1受体(GLP-1R)结合发挥作用。GLP-1结合GLP-1R后，激活细胞膜内环腺苷酸(cAMP)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路。胰岛成熟β细胞的GLP-1受体偶联Gs，活化腺苷酰环化酶，产生cAMP，后者与葡萄糖协同刺激胰岛素合成和分泌，刺激胰岛素基因转录和胰岛素原生物合成，可降低胰高血糖素浓度并抑制胰高血糖素分泌，增强细胞对胰岛素的敏感性，刺激胰岛素依赖性糖原合成，降低餐后血糖浓度；通过激活蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、MAPK通道，调节凋亡前蛋白及诱导抗凋亡蛋白Bcl-2与Bcl-xL的表达，以减缓β细胞凋亡，增进其再生，促使胰岛β细胞分化并增殖。GLP-l诱导多种生物学效应，例如剌激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空、抑制胃运动或肠运动及诱导重量减轻。GLP-l的显著特征是剌激胰岛素分泌而无低血糖相关的危险。GLP-l(1-37a.a)活性很低，并且GLP-l(7-37a.a)和GLP-l(7-36)这两种天然存在的截短肽在体内被迅速清除，并且具有极短的体内半衰期，这限制了GLP-l治疗的有效性。已知内源性的二肽基酶4(DPP4)通过切割GLP-l肽N末端组氨酸和丙氨酸残基，而使循环的GLP-l肽失活。因此生产一种生理作用与GLP-1类似但不能被很快降解的GLP-1类似物成为研究的热点。目前市场上获批的GLP-1药物主要有从蜥蜴唾液中分离出的Exenatide-4，以及采用脂肪酸，抗体Fc段或血清白蛋白修饰的人源GLP-1类似物。在这些产品中以诺和诺德公司的脂肪酸修饰的利拉鲁肽在降血红蛋白糖基化及降体重方面最有效且副作用较少。但其不足方面是体内半衰期只有13小时，需要每天给药。且根据最新的结构信息分析，GLP-1脂肪酸修饰后虽然大大提高了其体内半衰期，但由于脂肪酸阻碍了其与受体结合，导致其生物活性降低，计量是其他产品的几十至上百倍。这大大增加了其服药成本，增加了药品副作用风险。因此开发出类似或好于利拉鲁肽药效,但半衰期大大增加,生物学活性更高,剂量更低的药物,具有巨大的市场需求和市场竞争力。
技术实现思路
本专利技术涉及一种新的GLP-1(7-37)多肽类似物(下称GLP-1M(7-37))，所述多肽类似物GLP-1M蛋白质的氨基酸序列与天然序列比较,其具有突变A8S和V33R。同时还可以有G16E和/或A24E突变。本专利技术还涉及一种SUMO-GLP-1M(7-37)融合蛋白质，以及编码所述SUMO-GLP-1M(7-37)融合蛋白质的多核苷酸序列基因，包含这些多核苷酸序列基因的载体、包括载体的宿主细胞，以及由这些多核苷酸序列基因翻译表达的GLP-1M蛋白质，由该GLP-1M蛋白质作为主要成分的降糖药物。本专利技术第一方面提供一种经密码子优化的编码SUMO-GLP-1M(7-37)融合蛋白质的多核苷酸序列基因。本专利技术第二方面提供一种构建的表达载体，其包含本专利技术第一方面的经密码子优化的编码SUMO-GLP-1M(7-37)融合蛋白质的多核苷酸序列基因。所述载体适合驱动异源DNA在细菌中翻译表达HPVL1蛋白质。在一个实施方案中，所述表达载体优选pET24(+)。本专利技术的第三方面提供一种构建的工程菌细胞，该细胞包含本专利技术第一方面的多核苷酸序列基因，或第二方面的表达载体。所述的工程菌宿主细胞是大肠杆菌，在一个实施方案中，所述宿主细胞优选BL21(DE3)细胞株。本专利技术第四方面提供多种种由密码子优化的SUMO-GLP-1M(7-37)多核苷酸序列基因表达的GLP-1M蛋白质的氨基酸序列。本专利技术第五方面提供一种GLP-1M蛋白质经脂肪酸修饰后形成的GLP-1类似物。本专利技术第六方面提供了一种药用组合物，其包含本专利技术GLP-1M脂肪酸修饰物，所述组合物中进一步包含可药用的制剂配方。在一个实施方案中，本专利技术还提供了一种包含本专利技术所述GLP-1M或GLP-1M脂肪酸修饰物的药物制剂，所述药物制剂还包含制药上可接受的载体或赋形剂，一个具体的实例可以是如包含GLP-1M脂肪酸修饰物，用1.4mg/ml磷酸氢二钠，5.5mg/ml苯酚，180mM乙醇丙二醇混合物(摩尔比1:4),pH＝7.9配制最终成品，-80度或4度保存。另一方面，本专利技术提供一种获得HPVL1五聚体的方法，其包括在表达系统中表达经密码子优化的HPVL1蛋白质，然后将含有该蛋白质的裂解上清进行纯化处理。具体方法包括：A.将设计合成的表达质粒转化到BL21(DE3)中构建工程菌细胞,在工程菌细胞中表达SUMO-GLP-1M融合蛋白质，离心收集菌体。B.破碎细胞，连续流离心加深层过滤法获取上清。C.采用亲和方法捕获目的融合蛋白。D.加入SUMO蛋白质酶切除SUMO标签，得到初步纯化的GLP-1M多肽。E.采用疏水层析纯化法进一步纯化目的多肽。F.采用等电点沉淀法获得目的多肽，用NaOH溶液调节pH11.0～12.5使溶液澄清、沉淀全部溶解，按照多肽与脂肪酸最佳摩尔比1:1.5-1:5加入脂肪酸，在15度条件下反应15-120分钟。加入NaOH至终浓度10-50mM,4-15度反应1小时获得修饰后GLP-1M。G.使用疏水层析法及反向纯化法纯化目的修饰多肽。H.采用等电点沉淀法获得目的多肽I.用1.4mg/ml磷酸氢二钠，5.5mg/ml苯酚，180mM乙醇丙二醇混合物(摩尔比1:4),pH＝7.9配制最终成品，-80度或4度保存。本专利技术所述的制备GLP-1M方法,其中所述GLP-1M蛋白质与天然蛋白比具有突变A8S和V33R。同时还可以有G16E和/或A24E突变。本专利技术所述的制备GLP-1M方法,其中所述GLP-1M蛋白质为经过大肠杆菌表达系统DNA密码子优化的GLP-1M基因。本专利技术所述的制备GLP-1M方法,其中所述原核宿主细胞选自但不限于X本文档来自技高网...

【技术保护点】
GLP‑1M(7‑37)多肽，所述多肽具有如下通式表示的氨基酸序列：蛋白序列GLP‑1M(A8S/V33R/G16E/A24E)H SEGTFTX8DVS SYLEX16QAAKE FIX24WLX33RGRG，其中：X8为S，X16为G或E，X24为A或E，X33为R。

【技术特征摘要】
1.GLP-1M(7-37)多肽，所述多肽具有如下通式表示的氨基酸序列：蛋白序列GLP-1M(A8S/V33R/G16E/A24E)HSEGTFTX8DVSSYLEX16QAAKEFIX24WLX33RGRG，其中：X8为S，X16为G或E，X24为A或E，X33为R。2.根据权利要求1所述的多肽，其中，X8为S，X16为G，X24为A，X33为R。3.根据权利要求1所述的多肽，其中，X8为S，X16为E，X24为E，X33为R。4.包含权利要求1-3中任意一权利要求所述多肽与长链脂肪酸结合形成的脂肪酸偶联物。5.融...

【专利技术属性】
技术研发人员：许峥，李峰，张华，吴玲，
申请(专利权)人：北京亦庄国际蛋白药物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11