一种带有醚键的胰高血糖素样肽－1（GLP－1）类似物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一类长效化胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)类似物及其合成方法。通过对GLP‑1进行改造得到具有更长药理作用时间的GLP‑1类似物，目标多肽的合成是是通过正交保护策略固相合成方法快速实现，粗品经纯化，冻干得到GLP‑1类似物。

A glucagon like peptide 1 (GLP 1) analogue with ether bond and its application

The present invention relates to one kind of long-acting glucagon like peptide 1 (GLP 1) analogs and synthesis method thereof. Based on the GLP 1 by modifying with longer pharmacological action time GLP 1 analogue, synthesis of the target polypeptide is quickly realized through orthogonal protection strategy of solid phase synthesis method, the crude product was purified and freeze-dried to obtain GLP 1 analogues.

【技术实现步骤摘要】
一种带有醚键的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其应用
本专利技术涉及糖尿病治疗领域的一种带有醚键的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其应用。
技术介绍
糖尿病是继肿瘤、心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病。目前，全球约有3亿糖尿病患者，预计到2025年将增加至5亿。临床上采用胰岛素强化治疗的方法来延缓糖尿病进程，但是注射胰岛素会有低血糖的风险。治疗效果受到剂量、注射部位、注射途径等因素的影响，且个体差异较大，使用胰岛素稍有不慎，就会出现严重的低血糖副作用。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种葡萄糖依赖性肠促降血糖多肽激素，GLP-1刺激胰岛素分泌而不出现低血糖，这种葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌特性，避免了糖尿病治疗中常存在的低血糖危险。因此，GLP-1作为一种2型糖尿病治疗药物具有广阔的开发前景。但是天然GLP-1在糖尿病治疗上具有诸多缺点，例如，它在体内易被二肽基肽酶IV(DPP-IV)快速降解。DPP-IV可特异性识别GLP-1的N末端8位丙氨酸(Ala)残基，从肽链N末端8位丙氨酸(Ala)处切除二肽，使其转变为无活性的形式，其体内半衰期仅5min左右。GLP-1肽链N末端是与GLP-1受体的结合部位，若其组氨酸残基丧失，将导致GLP-1完全失去生物活性。目前普遍使用的延长GLP-1体内半衰期的修饰策略主要是对8位进行修饰，使得GLP-1能抵抗DPP-IV酶的降解，另外，将GLP-1肽链N端8位和9位的氨基酸互换也可以达到此目的。例如，艾塞那肽和利西拉来是减少DPP-IV酶代谢的典型短效GLP-1受体激动剂。然而，由于GLP-1会被肾脏快速滤过消除，抵抗DPP-IV酶的降解只能一定程度地延长GLP-1的半衰期。本专利中，在内源性GLP-1(7-36)-NH2的基础上，采用半胱氨酸-马来酰亚胺缀合策略，设计合成了一类GLP-1类似物。该策略通过半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺发生迈克尔加成反应来方便高效地引入小分子基团，可避免在早期GLP-1受体长效化激动剂的研发过程中，采用赖氨酸作为小分子基团连接臂所引起的选择性差、反应不方便等问题。引入的双香豆素小分子基团具有较高的血清白蛋白结合率，可增强缀合物与血清白蛋白的结合，很大程度地延长了化合物的半衰期，并可减少GLP-1的肾脏快速滤过和代谢失活，因而此类化合物的半衰期及体内降糖作用时间显著延长。更重要的是，本专利中，突破性地采用短聚乙二醇作为连接臂，增加了化合物的水溶性，提高了受体激动活性。而早期缀合物中采用脂肪酸连接臂，屏蔽了GLP-1肽链的受体结合部位，在一定程度上影响了GLP-1受体激动活性。总之，该类化合物具有更优的成药性，在较小的给药剂量下，即可将血糖稳定在正常水平，能够减少病人多次注射给药的痛苦，提高病人依从性，是2型糖尿病治疗领域中极具发展前景的药物。
技术实现思路
本专利技术涉及一类带有醚键的长效化胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，其特征是，多肽氨基酸序列为：His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Xaa2-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2；或His-Xaal-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa2-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2；或His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Xaa2-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2；或His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa2-Gly-Arg-NH2；或His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa2-NH2；其中Xaa1取自Aib，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val；Xaa2为化学修饰的Cys，其结构为：n为自然数0，1，2，3，4，5。本专利技术的优选方案，其特征是，Xaa1取自Aib，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val；Xaa2为化学修饰的Cys，其结构为：在一个实施方案中，本专利技术涉及具有如下序列的GLP-1类似物：本专利技术突破性地采用短聚乙二醇作为连接臂，与早期缀合物中的脂肪酸连接臂相比，增加了化合物的水溶性，提高了受体激动活性。本专利技术还提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种上述化合物和其药学上可接受的盐，或药学上可接受的载体或稀释剂。本专利技术进一步提供了上述化合物和其药学上可接受的盐，或药学上可接受的载体或稀释剂在制备用于治疗糖尿病的药物中的运用。本专利技术提供的上述化合物具有显著的降糖效果，而且化学性质稳定，部分的化合物降血糖作用可维持40h以上，较内源性GLP-1(半衰期2～3min)或上市药物艾塞那肽(半衰期2.4h)有显著的提高。同时，避免了药剂学长效化方法所引起的局部瘙痒等不良反应。本专利技术还提供了上述化合物的制备方法，本专利技术采用固相合成策略高效快速地合成得到上述目标化合物。以下是本专利技术中涉及的GLP-1类似物的相关药理实验方法以及结果：1、GLP-1类似物的受体激动活性实验HEK293细胞共转染编码GLP-1R的cDNA，细胞系表达并利用WesternBlot检测已构建的HEK293细胞中GLP-1R的蛋白水平，以考察是否建立了稳定高表达的GLP-R-HEK293细胞株。受体激动活性实验中，首先，将细胞种于96孔板中，2h后，化合物用DMSO溶解，使用含有0.1％牛血清蛋白的培养基稀释至不同倍数，加入共转染的GLP-1R-HEK293细胞中。孵育20min后，使用Cisbo公司的ELISA试剂盒检测相应的cAMP值，非线性回归后计算化合物的EC50数值。表1EC50valuesofcompounds如表1所示，所有化合物对GLP-1R的激动活性都得到保留，与上市药物利拉鲁肽相比有明显提高。其中化合物SEQ.IDNO：1对GLP-1R的激动活性与内源性GLP-1相近，较利拉鲁肽提高了2倍左右。2、GLP-1类似物的腹腔葡萄糖耐量实验正常昆明小鼠，随机分组，每组8只，小鼠饲养在标准化动物房中。实验前12小时禁食，只给予饮水。每组小鼠在给药GLP-1类似物之前，测本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术涉及一种带有醚键的长效化胰高血糖素样肽‑1类似物，其特征是，多肽氨基酸序列为：His‑Xaa1‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Val‑Xaa2‑Ser‑Tyr‑Leu‑Glu‑Gly‑Gln‑Ala‑Ala‑Lys‑Glu‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Lys‑Gly‑Arg‑NH2；或His‑Xaa1‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Val‑Ser‑Xaa2‑Tyr‑Leu‑Glu‑Gly‑Gln‑Ala‑Ala‑Lys‑Glu‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Lys‑Gly‑Arg‑NH2；或His‑Xaa1‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Val‑Ser‑Ser‑Tyr‑Leu‑Glu‑Gly‑Gln‑Ala‑Ala‑Xaa2‑Glu‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Lys‑Gly‑Arg‑NH2；或His‑Xaa1‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Val‑Ser‑Ser‑Tyr‑Leu‑Glu‑Gly‑Gln‑Ala‑Ala‑Lys‑Glu‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Xaa2‑Gly‑Arg‑NH2；或His‑Xaa1‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Val‑Ser‑Ser‑Tyr‑Leu‑Glu‑Gly‑Gln‑Ala‑Ala‑Lys‑Glu‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Lys‑Gly‑Arg‑Xaa2‑NH2；其中Xaa1取自Aib，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val；Xaa2为化学修饰的Cys，其结构为：...

【技术特征摘要】
1.本发明涉及一种带有醚键的长效化胰高血糖素样肽-1类似物，其特征是，多肽氨基酸序列为：His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Xaa2-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2；或His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa2-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2；或His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Xaa2-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2；或His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa2-Gly-Arg-NH2；或His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa2-NH...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄文龙，钱海，蔡星光，戴雨轩，孙李丹，韩京，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32