一种人表皮细胞无血清培养基及其培养方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种细胞培养基及其培养方法与应用，尤其是一种人表皮细胞无血清培养基及其应用。本无血清培养体基是采用以ＩＭＤＭ培养为基础，加入自行研制的无血清培养基血清替代物，包括过氧化氢酶、牛血清白蛋白、人转铁蛋白、胆固醇、胰岛素、氢化可的松等，再补充表皮细胞生长因子、牛垂体提取物、乙醇胺等组成人表皮细胞无血清培养基。本发明专利技术的无血清培养体系可用于传代和原代人表皮细胞体外无血清培养，本发明专利技术排除了血清中众多不明细胞因子，如抗原、抗体、激素等干扰，可提高某些药物或因子对表皮细胞影响研究的准确度和精确性，并可用于在烧伤治疗学、整形美容学和皮肤学等领域。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种细胞培养基及其培养方法与应用，尤其是一种人表皮细胞无血清培养基及其应用。本专利技术的技术方案为一种人表皮细胞无血清培养基，包括牛血清白蛋白，人转铁蛋白，胰岛素，胆固醇，过氧化氢酶，还包括0.01-10微克/毫升的氢化可的松。较优的技术方案有下列一种人表皮细胞无血清培养基，包括80-120毫克/毫升牛血清白蛋白，7-12微克/毫升人转铁蛋白，60-100微克/毫升胰岛素，150-250微克/毫升胆固醇，150-250微克/毫升过氧化氢酶，还包括0.1-0.8微克/毫升的氢化可的松。一种人表皮细胞无血清培养基，包括100毫克/毫升牛血清白蛋白，10微克/毫升人转铁蛋白，80微克/毫升胰岛素，200微克/毫升胆固醇，200微克/毫升过氧化氢酶，还包括0.4-0.5微克/毫升的氢化可的松。该无血清培养基较适用于人表皮细胞生存培养。一种人表皮细胞无血清培养基，牛血清白蛋白经去毒处理。一种人表皮细胞无血清培养基，牛血清白蛋白经去毒处理的步骤50g牛血清白蛋白溶于100ml三蒸水中，置于4℃、24小时；加树脂珠5-10g混合搅拌均匀，置于4℃下2-4小时，离心去树脂珠，收集上清液；将上清液再加入树脂珠5-10g混匀，4℃静置2小时后，再室温静置2小时，去树脂珠；每50ml经树脂处理后的上清液，加入磷酸盐缓冲液配制成10％牛血清白蛋白，过滤除菌，-30℃保存备用。一种人表皮细胞无血清培养基，还加入5-15倍IMDM基础培养基，5-15微克/升表皮细胞生长因子，25-100毫克/升牛垂体提取物，乙醇胺0.5-4×10-5mol/升。一种人表皮细胞无血清培养基，还加入9-11倍IMDM基础培养基，9-10微克/升表皮细胞生长因子，40-70毫克/升牛垂体提取物，乙醇胺1-2×10-5mol/升。表皮细胞生长因子，牛垂体提取物，乙醇胺对人表皮细胞生长有利，该无血清培养基较适用于人表皮细胞生长培养。一种人表皮细胞无血清培养方法，其特征在于按下列步骤进行(1)取人皮肤，加胰蛋白酶处理，加入IMDM培养基配成单个细胞悬液；(2)无血清培养基配制IMDM培养基加10％人表皮细胞无血清培养基；其中人表皮细胞无血清培养基包括牛血清白蛋白，人转铁蛋白，胰岛素，胆固醇，过氧化氢酶，氢化可的松；(3)再补充表皮细胞生长因子，乙醇胺，牛垂体提取物，配制成人表皮细胞无血清培养基；(4)将分离的人表皮细胞用无血清培养基配制成浓度为0.5-4×10-6/毫升，接种于用经多聚赖氨酸预处理塑料培养板或培养皿中，置于细胞培养箱中培养，其中多聚赖氨酸预处理塑料培养板或培养皿方法将0.1毫克/毫升多聚赖氨酸置于塑料培养板或培养皿，室湿静置30分钟，无菌超净台中吹干，用生理盐水洗一次；吸干生理盐水即可接种人表皮细胞。人表皮细胞无血清培养基，应用于人表皮细胞生存生长培养。我们一直从事表皮细胞体外培养研究，已建立了有血清体外培养表皮细胞的方法。配制无血清培养基血清替代物。根据细胞培养所需营养成份的特点，寻找血清替代物的组成，并进行各种加入物质的浓度筛选，确定最佳的浓度和组成。其中，牛血清白蛋白在配制前需用树酯去毒素处理，效果更好。配制人表皮细胞无血清培养基，根据表皮细胞生长所需特殊因子的需要，选用IMDM作为基础培养基，再补充表皮细胞生长因子，牛垂体提取物，乙醇胺，促进表皮细胞贴壁生长。并筛选各种补充因子的最佳浓度。比较本研制的新型人表皮细胞培养基与有血清培养、国外已有的人表皮培养基MCDB153培养表皮细胞效果，以证明本专利技术新型培养基的优点和效果。专利技术优点和效果 1、本专利技术研究配制的无血清培养体系应用于人表皮细胞体外培养，其效果与有血清比较无明显差别。在倒置显微镜下动态观察无血清组与有血清组表皮细胞生长特点和生长速度相似。电镜观察无血清条件下培养14天的表皮细胞其结构清晰，胞内见大量束状张力丝和张力原纤维。相邻的细胞间明显的桥粒结构相连，说明无血清条件下培养的表皮细胞能形成表皮片，同时提示我们研制的无血清培养体系可替代血清用于表皮细种体外培养。2、本专利技术研制的无血清培养体系不仅适合于传代表皮细胞培养，而且适合于原代表皮细胞培养。在此之前，国内外一般采用的无血清培养是MCDB153，但该培养基仅适用于低密度接种传代的表皮细胞生长。所以，很多研究工作者只有将分离的原代表皮细胞先采用有血清培养，待细胞贴壁生长良好后才逐渐换成MCDB153培养。为寻求更近似于生理状态的培养条件，探索适合于原代表皮细胞生长的培养体系，我们以IMDM培养基为基础培养基，添加过氧化氢酶、牛血清白蛋白、人转铁蛋白、胰岛素、胆固醇、氢化可的松成为无血清限定培养基，再补充表皮细胞生长因子、牛垂体提取物、乙醇胺等组成无血清完全培养基。同时，考虑到无血清培养中缺少贴壁因子，我们采用多聚赖氨酸预先处理培养器皿。通过对各种补充因子及其浓度的反复筛选，成功地建立了适合于原代及传代表皮细胞培养的无血清培养体系。MCDB153购于美国Sigma公司；IMDM(Iscove’s Modufied Dulbeccos Medium)购于美国Gibco公司。3、本专利技术配制的无血清体系的几个主要特色(1)在人表皮无血清培养体系中加入过氧化氢酶是我们独有的。我们的实验结果提示随着加入的过氧化氢酶浓度增大，表皮细胞DNA合成增加，证明过氧化氢酶在无血清培养中对细胞生长的重要作用。其作用机理是表皮细胞培养过程中可产生过氧化氢，而过氧化氢是细胞生长的主要毒性物质，它可使细胞膜上的饱和脂肪酸氧化、细胞蛋白质氧化和/或DNA损伤而引起细胞死亡。过氧化氢酶则可降解过氧化氢而使细胞免受该毒性物质的作用。(2)本专利技术中采用的IMDM培养基是在DMEM培养基的基础上补充氨基酸、无机盐和维生素等11种成份组成，其中所含亚硒酸钠浓度高于MCDB153，已知亚硒酸钠是谷胱苷肽氧化酶的辅酶成份，较高浓度的硒有利于人表皮细胞生长。(3)采用多聚赖氨酸为底物。由于无血清培养基中不含血清，缺少血清中一些有利于细胞贴壁的因子。因此，如何提高无血清条件表皮细胞贴壁、集落形成和融合片的速度，成为表皮细胞无血清培养中重要的一步。一些学者采用3T3细胞滋养层、胶原及纤维联接蛋白来促进表皮细胞贴壁和集落形成，均获一定效果。但3T3作为异种的具有间变性质的细胞，会产生和表达对人体不利的代谢产物和抗原，目前其应用尚存很大的争议。胶原使用前需氨薰和紫外线照射过夜，制作比较复杂。纤维联接蛋白如果残留在培养液中可明显抑制表皮细胞增殖。本实验采用多聚赖氨酸预先处理培养器皿，结果能明显提高表皮细胞的贴壁、集落形成和膜片形成速率，同时对培养的表皮细胞生长无不利影响。其作用机理可能是①多聚赖氨酸带阳性电荷，吸附于器皿表面可改变普通器皿的阴性电荷，提高带阴性电荷细胞的贴附率。②多聚赖氨酸等贴壁因子可与表皮细胞表面受体发生相互作用，促进细胞贴壁生长。(4)本无血清体系中其它几个主要补充因子的作用是①牛血清白蛋白除可提供足够的脂肪酸以满足细胞生长的需要外，它还可结合某些金属离子(如Ca++等)，使其游离浓度降低，已知低钙环境对表皮细胞生长有利；②胆固醇有利于细胞增殖分化；③牛垂体提取物具有较强致有丝分裂作用；④乙醇对表皮细胞生长因子有协同作用，促进表皮本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人表皮细胞无血清培养基，包括牛血清白蛋白，人转铁蛋白，胰岛素，胆固醇，过氧化氢酶，其特征在于：还包括０．０１－１０微克／毫升的氢化可的松。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国安，袁利亚，刘德伍，辛国华，戴育成，
申请(专利权)人：江西医学院，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]