7-羟基香豆素吡唑啉衍生物在制备GRP94抑制剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种3‑(1,5‑二苯基‑4,5‑二氢‑1H‑吡唑‑3‑基)‑7‑羟基‑2H‑色烯‑2‑酮在制备GRP94抑制剂中的应用；其中有效抑制GRP94生物学功能的3‑(1,5‑二苯基‑4,5‑二氢‑1H‑吡唑‑3‑基)‑7‑羟基‑2H‑色烯‑2‑酮的浓度为1～10μM。本发明专利技术提供的应用为研制开发有关GRP94的抑制剂奠定了基础，所述化合物还可以作为一种有效的化学工具为研究GRP94的生物学功能提供有力手段。

7 hydroxycoumarin pyrazoline derivatives in the preparation of the application of GRP94 inhibitor.

The invention discloses a (3 1,5 two 4,5 two phenyl hydrogen 1H pyrazole 3 base) 7 2H chromen hydroxy 2 ketone in the preparation and application of GRP94 inhibitors; which effectively inhibit the biological functions of GRP94 3 (1,5 two phenyl 4,5 two 1H hydrogen pyrazole 3 base) 7 2H chromen hydroxyl concentration of 2 ketone is 1 ~ 10 M. The invention provides a basis for the development and development of inhibitors for GRP94, and the compound can also be used as an effective chemical tool to provide a powerful means for studying the biological function of GRP94.

【技术实现步骤摘要】
7-羟基香豆素吡唑啉衍生物在制备GRP94抑制剂中的应用
本专利技术涉及一种香豆素吡唑啉荧光化合物的应用，尤其涉及7-羟基香豆素吡唑啉衍生物即3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)-7-羟基-2H-色烯-2-酮在制备GRP94抑制剂中的应用。
技术介绍
GRP94(葡萄糖调节蛋白94)由HSP90B1基因编码，是HSP90(热休克蛋白90)在内质网中的亚型，在结构上与HSP90高度保守。GRP94主要参与细胞内分泌蛋白和膜蛋白的折叠和装配。临床研究表明，GRP94参与黑色素瘤、卵巢癌、多发性骨髓瘤、肺癌等一系列癌症的发展和转移，GRP94已成为肿瘤治疗的新靶点。此外，GRP94也会参与到自身免疫以及炎症相关疾病中。GRP94的分子伴侣功能主要依赖于它的ATP酶结构域，在结构上不同于HSP90，因此设计合成特异性靶向GRP94的抑制剂用于肿瘤等疾病的治疗具有重要意义。然而，目前关于GRP94抑制剂的研究较少，亟待开发可以用于临床研究的GRP94抑制剂。香豆素是自然界中一类重要的天然有机化合物，具有抗肿瘤、抗菌、抗HIV、抗氧化、抗凝血、抗抑郁、消炎止痛和保护肝脏等药理作用。新生霉素是香豆素类抗生素的代表药，对多种癌细胞有抑制作用，能与抗癌药联合应用，逆转抗癌药的耐药性。新生霉素可抑制HSP90的活性，通过与HSP90的C端ATP位点结合，而产生抗肿瘤作用。香豆素类化合物具有药理运用较广、生物利用度高、合成较为简单、分子量较小和低毒性等特点。吡唑啉衍生物是一类重要的含氮五元杂环化合物。吡唑啉类化合物具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗变形虫、抗高血压、抗抑郁、消炎止痛和抑制免疫等功能。此类化合物还具有良好的光学性质，普遍应用于纺织品的荧光增白剂、荧光探针、染料等方面。香豆素和吡唑啉衍生物均为重要的有机化合物，在有机合成领域获得广泛应用。3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)-7-羟基-2H-色烯-2-酮即为香豆素吡唑啉衍生物，其结构式为：分子式：C24H18N2O3分子量：382.1317，性状：固体粉末。经权威机构检索查新，利用上述香豆素吡唑啉衍生物3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)-7-羟基-2H-色烯-2-酮作为GRP94抑制剂的研究与应用，目前国内外尚未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)-7-羟基-2H-色烯-2-酮在制备GRP94抑制剂中的应用。本专利技术所述3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)-7-羟基-2H-色烯-2-酮(HCP1)在制备GRP94抑制剂中的应用。其中：有效抑制GRP94生物学功能的3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)-7-羟基-2H-色烯-2-酮的浓度为1～10μM。优选的，有效抑制GRP94生物学功能的3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)-7-羟基-2H-色烯-2-酮的浓度为10μM。为了更好地理解本专利技术的实质，下面用3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)-7-羟基-2H-色烯-2-酮的生化和细胞实验及结果来阐明其在制备GRP94抑制剂及其相关研究中的应用。采用生物化学、细胞生物学和分子生物学的方法，进行如下实验：其中所述3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)-7-羟基-2H-色烯-2-酮在以下实验中简称HCP1。1、HCP1与GRP94直接相互作用通过Biacore表面等离子体共振的方法在体外检测HCP1与GRP94蛋白之间的相互作用。将GRP94蛋白固定于CM5芯片上，分别使用2.74μM,1.83μM,1.22μM,0.81μM和0.54μM的HCP1进行注射，获得HCP1与GRP94相互作用时的传感图和平衡解离常数。结果表明：通过BiacoreT200所得的响应值和HCP1成浓度对应关系，HCP1和GRP94相互作用的平衡解离常数为1.683μM，说明HCP1可以直接结合到GRP94上。(见图1)。2、HCP1在细胞内与GRP94共定位利用HCP1的荧光特性，通过激光扫描共聚焦显微镜检测HCP1在A549细胞内的发光情况和分布情况。通过免疫荧光染色检测HCP1与GRP94在A549细胞内的共定位情况。结果表明：(1)在405nm，488nm和546nm的激发波长下HCP1在细胞内发射荧光。633nm和647nm波长激发时HCP1不发荧光。HCP1分布于A549细胞的胞质中，在细胞核内没有分布。(2)HCP1和GRP94在细胞内共定位。说明HCP1特异性的靶向GRP94(见图2)。3、HCP1抑制GRP94的生物学功能GRP94作为内质网中重要的分子伴侣蛋白，参与协助TLR9由内质网到溶酶体和内体的转运过程。通过免疫荧光双染法检测HCP1对TLR9在A549细胞内由内质网向溶酶体转运的影响。使用溶酶体标记蛋白LAMP2对溶酶体进行标记。A549细胞经GRP94siRNA干扰GRP94的蛋白表达，HCP1(10μM)或HSP90α和HSP90β的抑制剂AUY922(50nM)处理24h后进行免疫荧光双染检测TLR9和溶酶体的共定位情况。通过westernblot检测GRP94siRNA对GRP94蛋白表达的干扰效率。HSP90在胞质中的亚型HSP90α和HSP90β受抑制时会引起HSP70蛋白水平的升高，而GRP94的抑制剂对HSP70的蛋白水平没有影响。使用不同浓度的HCP1(1μM，5μM和10μM)处理A549细胞24h,westernblot检测HSP70的蛋白水平变化。结果表明：(1)HCP1处理和GRP94siRNA可以降低TLR9和溶酶体的共定位。说明HCP1可以抑制TLR9由内质网到溶酶体的转运。(2)HCP1处理并不引起细胞内HSP70蛋白水平的变化。说明HCP1抑制GRP94的生物学功能，同时并不影响胞质中HSP90的功能。这为HCP1作为GRP94的抑制剂提供了很好的理论基础(见图3)。上述的实验数据统计学处理：实验数据以平均值±标准误差表示，经t检验：P<0.05表示有显著性差异；P<0.01表示有极显著性差异。由上述实验及其结果，可以得出如下结论：HCP1与GRP94直接相互作用。在细胞内HCP1仍然具有荧光特性，与GRP94存在共定位。说明HCP1特异性的靶向GRP94。HCP1抑制GRP94协助TLR9在胞内的转运功能，并且不影响细胞质中HSP90的功能。这为HCP1作为GRP94的抑制剂提供了很好的理论基础。GRP94作为HSP90在内质网中的亚型，参与到肿瘤，自身免疫和炎症相关的疾病中。GRP94的抑制剂可以通过抑制GRP94的生物学功能抑制肿瘤的发展和转移。本专利技术提供的3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)-7-羟基-2H-色烯-2-酮为研制开发有关GRP94的抑制剂奠定了基础。该化合物还可以作为一种有效的化学工具为研究GRP94的生物学功能提供有力手段。附图说明图1：HCP1与GRP94直接相互作用。A：HCP1化学结构式。B：通过BiacoreT200测定HCP1和本文档来自技高网...

【技术保护点】
3‑(1,5‑二苯基‑4,5‑二氢‑1H‑吡唑‑3‑基)‑7‑羟基‑2H‑色烯‑2‑酮在制备GRP94抑制剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)-7-羟基-2H-色烯-2-酮在制备GRP94抑制剂中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征是：有效抑制GRP94生物学功能的3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗俊英，赵宝祥，张尚立，苏乐，魏群，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37