本发明专利技术公开了一种应用RPA‑LFD现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明专利技术还公开了用于检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒。本发明专利技术提供的多杀性巴氏杆菌RPA‑nfo检测引物与探针组合以及试剂盒灵敏度高、特异性强，最低可以检测到6拷贝/反应的多杀性巴氏杆菌DNA。无需特殊仪器设备，借助恒温水浴锅或人体腋窝温度，25min就能对待测样本的粗裂解物进行多杀性巴氏杆菌DNA的灵敏、特异、快速地检测，适合现场或基层多杀性巴氏杆菌病的诊断工作。
【技术实现步骤摘要】
用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒
本专利技术涉及微生物检测
，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条技术，用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒。
技术介绍
多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamutocida，Pm)是引起多种畜禽巴氏杆菌病的革兰氏阴性病原菌，一般寄生于动物的上呼吸道，具有条件致病性，在某些应激条件刺激下，可引起带菌动物发生以出血性败血病或呼吸系统疾病。家畜中以牛、猪、兔、绵羊发病较多，山羊、鹿、骆驼、马、驴、犬、猫和水貂等亦可感染发病。禽类中以鸡、火鸡和鸭最易感，鹅、鸽次之。根据荚膜抗原的特异性，可将Pm分为5个血清型(A、B、D、E、F)。在我国，引起禽和猪巴氏杆菌病的主要病原是荚膜血清A型Pm，引起牛的主要为荚膜A型和B型Pm，荚膜A型主要表现为牛纤维素性化脓性肺炎，荚膜B型主要表现为牛出血性败血症。由于Pm可以在同种或不同种动物间互相传染，对养殖业危害严重。多杀性巴氏杆菌病的病原学诊断方法主要有细菌的分离培养、生化鉴定、动物回归试验等，这些方法费时、操作繁琐、准确率低，不适合临床快速诊断的需要。近年来PCR方法已经大量应用在巴氏杆菌病的诊断中，根据多杀性巴氏杆菌保守基因设计引物，可以诊断荚膜A、B、D、E和F5个血清型。但由于PCR方法需要特殊的仪器设备和专业的技术人员，在基层条件差和技术人员匮乏的情况下，现场实地快速诊断很难实现。此外，现有的采用PCR诊断多杀性巴氏杆菌的报道中，其设计引物所依据的保守基因序列有多种，有的以多杀性巴氏杆菌毒素基因(toxA)作为保守序列设计引物(CN104073567A)；有的以多杀性巴氏杆菌的的PlpB基因作为靶基因设计引物(“猪多杀性巴氏杆菌环介导等温扩增检测方法的建立”，中国预防兽医学报，2014年12月)，而根据不同的靶标(保守基因)设计的引物序列不同，对巴氏杆菌的诊断和检测效果也存在较大差异，因此，选择何种靶标作为引物设计的依据也是PCR诊断多杀性巴氏杆菌的难点之一。LAMP技术虽然可以进行核酸的恒等温扩增，但由于它的反应温度在60℃-65℃，反应时间在30-60min，仍然不能在常温下进行，并且不能对核酸粗提物的DNA样本进行直接扩增。因此，从诊断的时效性方面考虑，亟需一种可用于现场恒等温条件下的简易核酸检测技术。重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技术是目前新出现的一种体外快速核酸扩增技术，在37℃左右就能发生反应，并且仅需十几分钟就能扩增出痕量级的检测产物。同时RPA可以完成核酸粗提物的扩增，它可以通过琼脂糖凝胶电泳，荧光扩增曲线和侧流层析试纸条(LateralFlowDipstick，LFD)三种方式检测结果，这三种方式的引物与探针反应原理是不同的。基本的RPA扩增只需上下游引物，产物通过凝胶电泳检测，而RPA-nfo和RPA-exo反应，是通过不同的探针结合到模板互补链后再通过核酸内切酶IV(nfo)和核酸内切酶III(exo)切割掉3'端阻止序列，这两种方法分别通过LFD(nfo)和实时荧光(exo)两种不同的手段检测结果。凝胶电泳和荧光扩增曲线法仍然依赖实验室和特殊仪器设备，而LFD是一种无需特殊仪器可用于现场的检测方法。将RPA技术与LFD技术结合，通过LFD读取结果，既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，借助恒温水浴锅用LFD就可以通过肉眼观察结果。但RPA技术属于新兴的核酸扩增技术，其应用并不十分普遍，其主要技术难点在于特异性引物和探针的设计和筛选，而引物/探针的设计和选择对RPA-nfo的结果是至关重要的，目前并没有像PCR扩增技术那样专门的引物/探针的设计软件，也没有较多的文献和试验数据提供技术依据。经相关检索，目前还未有针对多杀性巴氏杆菌进行RPA-LFD检测的相关报道。综上，对于多杀性巴氏杆菌的RPA-LFD检测，目前尚无明确可借鉴的思路和结果，还需要技术人员做大量和深入的研究。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针；其RPA-nfo正向引物序列如SEQIDNO.1所示，反向引物序列如SEQIDNO.2所示，其RPA-nfo探针序列如SEQIDNO.3所示。具体序列如下：正向引物：5'-TTGCCGCGAAATTGAGTTTTATGCCACTTG-3'；(SEQIDNO.1)反向引物：5'-(Biotin)AATAACGTCCAATCAGTTGCGCCGTTGTCA-3'；(SEQIDNO.2)探针：5'-(FAM)ATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTG(dSpacer)GCTTGTCGGTAGTCTT(C3-Spacer)-3'(SEQIDNO.3)。本专利技术的探针，在其5'端用FAM标记，距离5'端30个碱基左右的位置处用dSpacer替代一个碱基，3’端用C3-spacer阻断。需要说明的是，与常规PCR反应不同，RPA-nfo反应所需引物的长度通常为30～35bp，引物过短会严重影响重组酶的活性；但长引物也并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性。LF探针长度一般在46～52bp，nfo核酶距离探针5'端30个碱基左右，距离3'端16～22个碱基左右，个别碱基的替换或增减都会对探针的特异性产生影响。因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本专利技术的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物和探针组合，然后进行试验进行优化、筛选才能得到。本专利技术设计了多组不同的引物和探针组合，经试验反复验证后，确定本专利技术所列出的上述引物和探针组合，其检测效果最佳。本专利技术的第二方面，提供一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒，该试剂盒中包含上述的引物和探针组合。进一步的，该试剂盒中还包括：阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA-nfo反应液。所述阳性质控标准品为：包含多杀性巴氏杆菌Kmt1基因片段阳性质控标准品；优选的，所述包含多杀性巴氏杆菌Kmt1基因片段阳性质控标准品由含有192个碱基的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成；所述含有192个碱基的核苷酸片段的序列如SEQIDNO.4所示。5'-CGATTGCCGCGAAATTGAGTTTTATGCCACTTGAAATGGGAAATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTGGGCTTGTCGGTAGTCTTTTATTTGGCTTGTGGCAAAGAAAAGCACAGTTTTGTTGGGCGGAGTTTGGTGTGTTGAGCCAATCTGCTTCCTTGACAACGGCGCAACTGATTGGACGTTATT-3'；(SEQIDNO.4)上述含有192个碱基的核苷酸片段是从多杀性巴氏杆菌核酸阳性的临床病料DNA模板中克隆得到。所述阴性质控标本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物和探针组合，包括RPA‑nfo正向引物、反向引物和RPA‑nfo探针，其特征在于，所述RPA‑nfo正向引物、反向引物和RPA‑nfo探针的序列如下所示：正向引物：5'‑TTGCCGCGAAATTGAGTTTTATGCCACTTG‑3'；反向引物：5'‑(Biotin)AATAACGTCCAATCAGTTGCGCCGTTGTCA‑3'；探针：5'‑(FAM)ATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTG(dSpacer)GCTTGTCGGTAGTCTT(C3‑Spacer)‑3'。
【技术特征摘要】
1.一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针，其特征在于，所述RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针的序列如下所示：正向引物：5'-TTGCCGCGAAATTGAGTTTTATGCCACTTG-3'；反向引物：5'-(Biotin)AATAACGTCCAATCAGTTGCGCCGTTGTCA-3'；探针：5'-(FAM)ATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTG(dSpacer)GCTTGTCGGTAGTCTT(C3-Spacer)-3'。2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备多杀性巴氏杆菌检测的试剂盒、芯片和/或扩增反应试剂中的用途。3.一种检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针组合。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括有：阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA-nfo反应液。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控标准品为包含多杀性巴氏杆菌Kmt1基因片段阳性质控标准品；优选的，所述的包含多杀性巴氏杆菌Kmt1基因片段阳性质控标准品，由含有192个碱基的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成；所述含有192个碱基的核苷酸片段的序列如SEQIDNo.4所示。6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控标准品为pEASY-T3空载质粒。7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA-nfo反应液，包...
【专利技术属性】
技术研发人员：何洪彬，赵贵民，侯佩莉，王洪梅，何成强，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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