血小板衍生生长因子的检测方法技术

本案涉及血小板衍生生长因子的检测方法，采用电化学的方法，在金电极表面修饰序列一，然后适配体一通过与序列一的互补配对也结合至电极表面；然后浸入包含待测样和适配体二的溶液中，样本中的血小板衍生生长因子(PDGF‑BB)会与适配体一及适配体二结合，进而将适配体一从电极表面取代下来，此时电极表面的序列一暴露出的黏性末端将触发杂交链式反应，其产物进一步吸附电活性物质六铵合钌，产生明显的电化学响应；通过电化学工作站读出差分脉冲伏安信息，经分析，其与PDGF‑BB浓度在一定的浓度范围内存在线性关系，检测限为0.3pg/mL，满足实际应用所需要的PDGF‑BB浓度水平。

Method for detecting platelet derived growth factor

This invention relates to a detection method of platelet derived growth factor, by electrochemical method, on the surface of the gold electrode modified sequence, and then through a aptamer sequence and complementary pairing is also bound to the electrode surface; and then immersed in the test sample and the aptamer contains two solution, in a sample of platelet-derived growth factor (PDGF BB) with aptamer and aptamer two combined, then an aptamer from the electrode surface to replace the sticky ends down, at the electrode surface exposed a series of hybrid will trigger a chain reaction, the product of the adsorption of electroactive material six ammonium ruthenium, have obvious electrochemical response; electrochemical workstation through reading the differential pulse voltammetry information, through analysis, and the PDGF BB concentration in a certain concentration there is a linear relation, the detection limit is 0.3pg/mL, meet the actual application The required PDGF BB level.

【技术实现步骤摘要】
血小板衍生生长因子的检测方法
本专利技术涉及一种血小板衍生生长因子的检测方法，尤其涉及一种基于邻位效应的电化学分析技术在血小板衍生生长因子检测上的应用。
技术介绍
血小板衍生生长因子(plateler-derivedgrowthfactor,PDGF)是血小板分泌的一种主要丝裂原，是一种重要的、作用于间充质细胞的血小板衍生因子。PDGF具有三种形式的二聚体结构，即PDGF-AA，PDGF-BB及PDGF-AB。PDGF-BB可以刺激成骨细胞的DNA合成和细胞的分裂复制，同时也可以促进成骨细胞合成胶原以及非胶原蛋白。因此，PDGF-BB可促进新生血管的形成和骨细胞的复制，参与骨折的早期修复。传统的PDGF-BB浓度检测方法是酶联免疫吸附法，然而这一方法面临着许多问题，如成本相对昂贵，灵敏度低，操作复杂等。近年来，电化学技术发展迅速，具有许多优点，如高灵敏度、快速响应和低成本。因此本专利技术开发出了一种选择性和敏感性高的检测PDGF-BB的新型电化学检测方法。
技术实现思路
针对现有技术中存在的技术问题，本案提供一种血小板衍生生长因子的检测方法，采用电化学的方法，在金电极表面修饰序列一(Initiator)，然后适配体一(aptamer1)通过与Initiator的互补配对也结合至电极表面。然后浸入包含待测样和适配体二(aptamer2)样品中，样本中的PDGF-BB会与aptamer1及aptamer2结合，进而将aptamer1从电极表面取代下来，此时电极表面的Initiator暴露出的黏性末端将促发链式杂交反应。杂交链式反应产物吸附电活性物质六铵合钌，产生明显的电化学响应。通过电化学工作站读出差分脉冲伏安(DPV)信息，经分析，其与PDGF-BB浓度在一定的浓度范围内存在线性关系，检测限为0.3pg/mL，满足实际应用所需要的PDGF-BB浓度水平。为实现上述目的，本案通过以下技术方案实现：一种血小板衍生生长因子的检测方法，其包括：1)以金电极作为工作电极，对金电极进行预处理；2)将序列一修饰于所述金电极表面；3)将巯基己醇修饰于所述金电极表面，用于对未修饰上序列一的金电极表面进行占位；4)将适配体一修饰到所述金电极上，以使适配体一与序列一互补配对；5)将所述金电极插入含适配体二的待测液中，以使得适配体一、适配体二和血小板衍生生长因子三者结合，并将适配体一从电极表面取代下来，从而使金电极表面的序列一暴露出黏性末端；6)将所述金电极与序列二、序列三和序列四结合，从而触发杂交链式反应，在金电极表面生成杂交链式反应产物；7)以六铵合钌作为电活性物质，采用差分脉冲伏安法获得所述杂交链式反应产物吸附六铵合钌后所产生的电化学响应信号；8)根据电化学响应信号与血小板衍生生长因子浓度的对应关系，获得待测液中血小板衍生生长因子的浓度；其中，序列一为ACATACAATAGATCGC-SH；序列二为GCGATCTATTGTATGTTTTAGCTTATCAGACTGATGTTGA；序列三为ATCAGACTGATGTTGATGAAACTCAACATCAGTCTGATAAGCTA；序列四为GTTTCATCAACATCAGTCTGATTAGCTTATCAGACTGATGTTGA；适配体一为ACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG；适配体二为CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTATACAGATACAATAGATC。优选的是，所述的血小板衍生生长因子的检测方法，其中，对金电极进行预处理包括：将金电极在修饰前浸泡于水虎鱼洗液中，以除去电极表面吸附的杂质；其中，以体积比为计，所述水虎鱼洗液的组成为98％H2SO4∶30％H2O2＝3∶1。优选的是，所述的血小板衍生生长因子的检测方法，其中，对金电极进行预处理还包括：将金电极分别用碳化硅砂纸和氧化铝粉末打磨至呈镜面光滑，随后将金电极分别在乙醇和蒸馏水中超声清洗，并最后在50％的HNO3溶液中浸泡30分钟。优选的是，所述的血小板衍生生长因子的检测方法，其中，对金电极进行预处理还包括：将金电极用0.5MH2SO4溶液清洗，随后用氮气干燥以待后续的修饰。优选的是，所述的血小板衍生生长因子的检测方法，其中，将序列一修饰于所述金电极表面具体包括：将经预处理的金电极与0.5μM的序列一溶液在室温下反应16小时。优选的是，所述的血小板衍生生长因子的检测方法，其中，将巯基己醇修饰于所述金电极表面具体包括：将已修饰有序列一的金电极在1mM巯基己醇溶液中浸泡60分钟，随后用双蒸水彻底冲洗并在氮气流中干燥待用。优选的是，所述的血小板衍生生长因子的检测方法，其中，所述差分脉冲伏安法采用三电极系统，其中，工作电极为金电极，对电极为铂电极，参比电极为饱和甘汞电极；差分脉冲伏安法所用缓冲液为含有50μM[Ru(NH3)6]3+的10mMTris-HCl溶液。本专利技术的有益效果是：本案通过杂交链式反应实现信号的放大，将待测物质PDGF-BB浓度的检测限大大降低，检测限达到了0.3pg/mL；此外，适配体与PDGF-BB浓度的结合显示了高亲和力和特异性，所提出的方法不仅适用于人类全血中的PDGF-BB测量，也可实现PDGF-BB生物传感的应用。附图说明图1为本案血小板衍生生长因子的检测原理示意图。图2为金电极不同修饰阶段的交流阻抗图：(a)裸金电极，(b)序列一修饰后，(c)与aptamer1作用后，(d)与PDGF-BB及aptamer2作用后，(e)与序列二、序列三、序列四作用后。图3为不同浓度PDGF-BB得到的差分脉冲伏安图：a-g分别为0、1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL和50ng/mL。图4为PDGF-BB浓度所对应的电信号值的校准图；图中误差条表示三次独立测量的相对标准偏差。图5为PDGF-BB检测量(100pg/mL)相对于其他过量(10ng/mL)的干扰生物分子：牛血清白蛋白(BSA)，谷氨酰胺转移酶(TG)，纤维蛋白原(Fibrinogen)的选择性。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本案列出一实施例的血小板衍生生长因子的检测方法，其包括：1)以金电极作为工作电极，对金电极进行预处理；2)将序列一修饰于金电极表面；3)将巯基己醇修饰于金电极表面，用于对未修饰上序列一的金电极表面进行占位，从而可以防止电极界面上的物理吸附；4)将适配体一修饰到金电极上，以使适配体一与序列一互补配对；5)将金电极插入含适配体二的待测液中，以使得适配体一、适配体二和血小板衍生生长因子三者结合，并将适配体一从电极表面取代下来，从而使金电极表面的序列一暴露出黏性末端；6)将金电极与序列二、序列三和序列四结合，从而触发杂交链式反应，在金电极表面生成杂交链式反应产物；7)以六铵合钌作为电活性物质，采用差分脉冲伏安法获得杂交链式反应产物吸附六铵合钌后所产生的电化学响应信号；8)根据电化学响应信号与血小板衍生生长因子浓度的对应关系，获得待测液中血小板衍生生长因子的浓度；其中，序列一为ACATACAATAGATCGC-SH；序列二为GCGATCTA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血小板衍生生长因子的检测方法，其特征在于，包括：1)以金电极作为工作电极，对金电极进行预处理；2)将序列一修饰于所述金电极表面；3)将巯基己醇修饰于所述金电极表面，用于对未修饰上序列一的金电极表面进行占位；4)将适配体一修饰到所述金电极上，以使适配体一与序列一互补配对；5)将所述金电极插入含适配体二的待测液中，以使得适配体一、适配体二和血小板衍生生长因子三者结合，并将适配体一从电极表面取代下来，从而使金电极表面的序列一暴露出黏性末端；6)将所述金电极与序列二、序列三和序列四结合，从而触发杂交链式反应，在金电极表面生成杂交链式反应产物；7)以六铵合钌作为电活性物质，采用差分脉冲伏安法获得所述杂交链式反应产物吸附六铵合钌后所产生的电化学响应信号；8)根据电化学响应信号与血小板衍生生长因子浓度的对应关系，获得待测液中血小板衍生生长因子的浓度；其中，序列一为ACATACAATAGATCGC‑SH；序列二为GCGATCTATTGTATGTTTTAGCTTATCAGACTGATGTTGA；序列三为ATCAGACTGATGTTGATGAAACTCAACATCAGTCTGATAA GCTA；序列四为GTTTCATCAACATCAGTCTGATTAGCTTATCAGACTGATGTTGA；适配体一为ACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG；适配体二为CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTATACAGATACAATAGATC。...

【技术特征摘要】
1.一种血小板衍生生长因子的检测方法，其特征在于，包括：1)以金电极作为工作电极，对金电极进行预处理；2)将序列一修饰于所述金电极表面；3)将巯基己醇修饰于所述金电极表面，用于对未修饰上序列一的金电极表面进行占位；4)将适配体一修饰到所述金电极上，以使适配体一与序列一互补配对；5)将所述金电极插入含适配体二的待测液中，以使得适配体一、适配体二和血小板衍生生长因子三者结合，并将适配体一从电极表面取代下来，从而使金电极表面的序列一暴露出黏性末端；6)将所述金电极与序列二、序列三和序列四结合，从而触发杂交链式反应，在金电极表面生成杂交链式反应产物；7)以六铵合钌作为电活性物质，采用差分脉冲伏安法获得所述杂交链式反应产物吸附六铵合钌后所产生的电化学响应信号；8)根据电化学响应信号与血小板衍生生长因子浓度的对应关系，获得待测液中血小板衍生生长因子的浓度；其中，序列一为ACATACAATAGATCGC-SH；序列二为GCGATCTATTGTATGTTTTAGCTTATCAGACTGATGTTGA；序列三为ATCAGACTGATGTTGATGAAACTCAACATCAGTCTGATAAGCTA；序列四为GTTTCATCAACATCAGTCTGATTAGCTTATCAGACTGATGTTGA；适配体一为ACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG；适配体二为CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪鹏，杨大威，王弼陡，孙海旋，唐玉国，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32