本发明专利技术提供的是一种用于体内软骨修复的转化生长因子复合支架的制备方法及其应用，即利用壳聚糖包裹生长因子，制备缓释微球，放入壳聚糖支架中，形成复合支架，主要用于吸附并诱导自身骨髓间充质干细胞，在缓释转化生长因子诱导下，于体内诱导为软骨细胞的应用，从而修复软骨缺损。优点：复合支架于体内原位诱导软骨修复生长，具有动态力学刺激，更容易与宿主的软骨组织粘附和整合，也能容易塑造出与关节匹配的轮廓；避免体外培养细胞表现的变异及植入细胞的免疫排斥反应；减少病原传播、致畸、去分化；应用于临床产生良好疗效；规模产业化，具有良好的经济效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种组织工程材料的制备方法及其应用，特别是多孔壳聚糖吸附自身骨髓间充质干细胞，在缓释转化生长因子诱导下，于体内诱导为软骨细胞的应用，属于组织工程材料领域。
技术介绍
早在1959年ft~idie就采用软骨下钻孔的办法修复关节软骨，随后，相继有不少人应用软骨下穿透术，如磨损关节成形术、软骨下钻孔术或微骨折术等方法修复关节软骨， 在短期内能恢复破坏的关节缺损面，但从长期效果而言，修复组织因纤维软骨的形成而不能承受关节的机械压力。目前，使损伤的骨软骨修复至正常骨软骨，尚无完善的方法。骨软骨移植术，用带有活力软骨细胞的正常透明软骨修复软骨缺损，有保持软骨生物化学和生物机械特性的优点，自体移植对儿童的效果较好，但存在自体可供软骨有限的缺点。相反，异体移植则存在容易感染的不足，且远期效果不能肯定。骨膜和软骨膜移植术是有潜力的方法，能引导移植物生长成软骨，但存在供体数量有限和修复组织易形成软骨内骨化的缺陷。随着细胞培养技术的发展，组织工程化软骨的研究成果燃起了人们治愈骨关节炎等软骨缺损性疾病的热情，尤其是转基因技术的应用使人们期望转染了促细胞增殖和定向分化的细胞因子的干细胞或软骨细胞能源源不断地形成软骨组织，以达到软骨形成与降解的平衡。然而，理想的组织工程化软骨在应用于临床前还有许多问题有待解决，离临床的实际应用还有一段距离。完全在体外充分培养形成的工程化软骨用于修复软骨缺损虽然有其优点，即可以调节细胞和组织的培养条件，细胞代谢和分化可以受到较在体内更好的控制， 然而其缺点也是显而易见的，与宿主组织的整合及达到力学上的可靠固定都是不易解决的问题。包含TGF-β 1缓释微球体的新型复合支架材料，在软骨下钻孔的软骨缺损模型中，利用自身的骨髓细胞在体内修复关节软骨缺损的能力，以探索修复关节软骨缺损的切实可行的治疗方法。
技术实现思路
目前，使损伤的骨软骨修复至正常骨软骨，尚无完善的方法。骨软骨移植术，用带有活力软骨细胞的正常透明软骨修复软骨缺损，有保持软骨生物化学和生物机械特性的优点，自体移植对儿童的效果较好，但存在自体可供软骨有限的缺点。相反，异体移植则存在容易感染的不足，且远期效果不能肯定。骨膜和软骨膜移植术是有潜力的方法，能引导移植物生长成软骨，但存在供体数量有限和修复组织易形成软骨内骨化的缺陷。为了解决上述内容技术中存在的不足地方，本专利技术提供了一种用于体内软骨修复的转化生长因子复合支架的制备方法，具体是一种缓释微球壳复合支架的制备方法及其应用，即利用壳聚糖包裹生长因子，制备缓释微球，放入壳聚糖支架中，形成复合支架，主要用于吸附并诱导自身骨髓间充质干细胞，在缓释转化生长因子诱导下，于体内诱导为软骨细胞的应用，从而修复软骨缺损。将复合支架植入体内能捕获自身的细胞和信号分子，其细胞分化过程合乎要求地发生在体内，并长期维持所形成的软骨细胞的活性。修复的组织在体内力学载荷的生理环境中进行分化和重建。原位修复生长更容易与宿主的软骨组织粘附和整合，也能容易塑造出与关节匹配的轮廓。在上述有关体外培养的工程化软骨所存在的许多基本问题没有解决前，用这种利用体内自身细胞的增殖和分化修复软骨缺损的方法似乎更切实际。用于实现本专利技术的具体技术方案如下转化生长因子缓释微球的制备采用乳化交联法，以司本-80为乳化剂，液体石蜡为油相，壳聚糖溶于乙酸为水相，在搅拌下形成W/0乳液，以三聚磷酸钠交联固化，用异丙醇及双蒸水反复漂洗微球，冷冻干燥得微球，以一定浓度的转化生长因子溶液浸渍在微球中，再次冻干得到缓释微球；复合支架的制备以一定浓度壳聚糖乙酸溶液于模板中低温冷冻，再行冷冻干燥，即得到多孔壳聚糖支架。然后将缓释微球放入支架中，冷冻干燥后形成复合支架。乙酸浓度在1%—5%，壳聚糖浓度1%—5% (w/ν)，司本-80的浓度在1%—8%，油水比在1%—10%，三聚磷酸钠的浓度0. lg/ml，转化生长因子溶液的浓度在5ng/y 1，转化生长因子与微球的质量比3 — 25ng/g。转化生长因子在4°C下浸渍于微球中M小时。冷冻干燥温度在-60°c。每个复合支架含转化生长因子3—25ng。以下对本专利技术的技术方案作出进一步的描述用于体内软骨修复的转化生长因子复合支架的制备具体包括以下步骤 TGF-β 1微球制备将150mg壳聚糖溶于6ml 2%的乙酸中；然后将30ml液体石蜡与 1. 5ml司本-80混均，在磁力搅拌下缓慢逐滴加入壳聚糖乙酸溶液，呈W/0乳液；当搅拌1小时后，用Iml注射器以20滴/分速度逐滴加入100g/LTPP10ml与之交联；继续搅拌1小时， 沉淀，异丙醇，双蒸水反复漂洗；冷冻干燥48小时得浅黄色粉末状微球；将Img壳聚糖微球与 2. 5 μ g/mlTGF- β 1 5 μ L，ρΗ=7. 4 时在 4°C充分浸润、膨胀 24h ；壳聚糖支架的制备将壳聚糖粉末溶解于1乙酸溶液中，搅拌混均过夜，真空抽滤去除不溶杂质得到终浓度为20 g/L的澄清壳聚糖凝胶备用；以M孔细胞培养板为模板，注入壳聚糖凝胶，_80°C低温冰箱冷冻过夜；冷冻干燥机预先制冷1小时，于负53度冷冻干燥机内，持续抽真空下冻干约48h，至完全干燥；所得支架经100%、95%、80%、70%乙醇使其梯度水化，每梯度各为lh，用0. 5N NaOH/乙醇混合溶液Gv/lv)中和过夜，最后大量70%乙醇冲洗，测PH值为中性，再次冷冻干燥制成三维多孔支架，该三维多孔支架厚10mm，直径15mm， 所有支架经环氧乙烷灭菌备用相分离法制备壳聚糖支架，取适量乳化交联法制备的壳聚糖微球于纯水中，超声使其分散，逐渐滴入所制支架中，真空抽滤无气泡，再次冷冻干燥得到复合支架，经环氧乙烷灭菌冷藏备用。本专利技术的有益效果体现在1、复合支架制备简单，对实验设备要求不高，便于普便推广。2、复合支架于体内原位诱导软骨修复生长，具有动态力学刺激，更容易与宿主的软骨组织粘附和整合，也能容易塑造出与关节匹配的轮廓。3、避免体外培养细胞表现的变异及植入细胞的免疫排斥反应。4、减少病原传播、致畸、去分化。5、应用于临床产生良好疗效。6、规模产业化，具有良好的经济效益。下面结合具体的实施例进一步说明本专利技术具体实施例方式实施例1、一种用于体内软骨修复的转化生长因子复合支架的制备方法，其中该方法主要是利用壳聚糖包裹生长因子，制备缓释微球，放入壳聚糖支架中，形成复合支架。实施例2、一种用于体内软骨修复的转化生长因子复合支架的制备方法，其中 转化生长因子缓释微球的制备，采用乳化交联法，以司本-80为乳化剂，液体石蜡为油相，壳聚糖溶于乙酸为水相，在搅拌下形成W/0乳液，以三聚磷酸钠交联固化，用异丙醇及双蒸水反复漂洗微球，冷冻干燥得微球，以一定浓度的转化生长因子溶液浸渍在微球中，再次冻干得到缓释微球；复合支架的制备，以一定浓度壳聚糖乙酸溶液于模板中低温冷冻，再行冷冻干燥，即得到多孔壳聚糖支架。然后将缓释微球放入支架中，冷冻干燥后形成复合支架。实施例3、一种用于体内软骨修复的转化生长因子复合支架的制备方法，其中乙酸浓度在1%— 5%，壳聚糖浓度1%—5% (w/v)，司本-80的浓度在1%— 8%，油水比在1%—10%，三聚磷酸钠的浓度0. lg/ml，转化生长因子溶液的浓度在5ng/μ 1，转化生长因子本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢宇，余远福，熊敏剑，洪小伟，熊辉，史少欣，李晓峰，黄山虎，
申请(专利权)人：南昌航空大学，
类型：发明
国别省市：
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