可控性HIV‑1基因组靶向编辑系统和其靶向载运系统技术方案

本发明专利技术涉及一种可控性HIV‑1基因组靶向编辑系统，包括spCAS9酶搭配多重gRNA表达质粒；所述质粒系统对spCAS9的表达添加了控制元件；所述多重gRNA针对HIV‑1基因组和/或CCR5的编码框基因组序列设计的靶向序列。为提高其靶向性，上述靶向编辑质粒系统加装了多重靶点的脂质体元件辅助输送至CD4、CCR5和/或CXCR4阳性的细胞；为降低对其他细胞的非特异性整合，该系统的质粒只在HIV‑1存在并具有活性时才能够整合；另外，实现了由TAT蛋白和R元件控制的CAS9的表达仅在HIV‑1活病毒存在时才能启动，病毒潜伏或失活后则关闭表达，减少了对靶细胞的潜在危险性。

【技术实现步骤摘要】
可控性HIV-1基因组靶向编辑系统和其靶向载运系统
本专利技术属于基因组编辑
，具体涉及HIV-1介导的基因组编辑和pDNA药物靶向输送系统。
技术介绍
目前随着基因的靶向操作技术的进展，清除外源感染病毒基因组或者改造自身体内某些有害基因的梦想逐渐成为现实，比如TALEN技术和CRISPR技术。二者各有优缺点，比如TALEN技术脱靶率很低，限于靶向性的DNA元件较大，超出多数载体的容量，因而很难用于多重打靶；而CRISPR技术仅采用一个核酸切割酶CAS9，搭载多个gRNA，可以实现多靶位切割，但是目前CRISPR存在一个缺点，即脱靶效应，对非特异性位点序列的切割会引起较大的潜在危险。spCAS9为细菌(化脓链球菌)蛋白，其在人体细胞内长期表达，将对机体基因组造成一定的威胁和激活细胞内部的免疫抗原提呈的风险。在制作基因靶向药物的时候要么需要短时表达，要么实现可控表达，而实现短时表达的策略，可以使用质粒DNA载体技术，在机体内作非整合型表达，该方法的质粒在细胞内表达时间短，会影响spCAS9的切割效果，对此需要提高质粒在细胞内的存留时间。目前虽然出现了一些附加体(episome)技术具有此能力，但目前所使用的附加体均来自于病毒，需要表达一些病毒蛋白以维持附加体的复制，但这些病毒蛋白对细胞具有较大的潜在危害，比如具有一定的致癌潜力，大大限制了其临床使用范围。为此整合型的质粒具有稳定的表达，如果实现可控性表达，将解决CAS9切割效果不足的缺点。但整合型的质粒一般需要特定的酶来介导，目前一般采用病毒介导的转入和整合，使用病毒载运DNA至细胞内，具有高效稳定的优点，但是也存在细胞非特异性感染、基因组随机整合、病毒的抗原性高、病毒感染的细胞特异性低、病毒制作繁琐、不易储运等缺点。随机整合的病毒对附近基因的表达造成干扰，引起基因的表达增加、突变或失活，在临床上面临一定的风险，限制门槛相对较高。比如腺相关病毒AAV对AAVS1位点的定点整合效率非常低，而其他病毒，比如慢病毒，基本没有定点整合的特点。鉴于上述的pDNA药物的载运缺点，对于一些特殊基因的靶向修饰和切割，现有技术没法实现定点整合，那么我们可以考虑降低非特异性细胞的药物载入和整合，仅将特异性整合局限于特定细胞群，这样就大大降低了发生非特异性整合的细胞范围，降低了相关药物的危险性。比如，针对艾滋病毒HIV-1的靶向CRISPR元件，如果实现仅在病毒感染的细胞中整合，那么就可以大大降低对非感染细胞的危害。病毒介导的特异性靶向，目前可以对病毒的衣壳蛋白作靶向性工程修饰，使其只对某些细胞表面受体具有亲和力，从而实现对表达特定受体的细胞进行整合。但HIV-1对CD4、CCR5和CXCR4结合的衣壳蛋白gp120在病人中有可能会出现中和抗体，而HIV-1自身的衣壳蛋白包被的病毒粒子比较脆弱，不耐纯化操作和保存，在一定程度上限制了其用于靶向性病毒介导的DNA输入和整合。因此人们采用了来自水泡型口炎病毒的衣壳蛋白VSVG，不仅增加了稳定性还增强了感染力和安全性，但由此也失去了对CD4阳性细胞感染的特异性和大大降低了对某些CXCR4阳性的淋巴干细胞的浸染能力，而使用麻疹病毒MV衣壳蛋白包被的慢病毒可以对上述T细胞具有一定的浸染能力，但是人群中对该病毒衣壳蛋白存在较大的免疫抵抗力，限制了其广泛应用。而且相当一部分HIV-1病毒会进入淋巴系统，感染CXCR4阳性的T淋巴祖细胞，尤其到感染的后期反弹阶段，这些CXCR4阳性的淋巴细胞成为病毒潜藏和不断向血液补充和释放病毒粒子的窝藏之地，而传统的化学药物对此也力不从心。对此，对于HIV-1的基因组靶向切割的CRISPR靶向元件，开发一种能够只整合那些HIV-1阳性的细胞而且安全性又高的载体技术，将具有重要的应用价值。除了对特定细胞类群的pDNA靶向输入外，还要有可控性的表达来进一步增加其安全性。对此，目前人们设计了多种可控性或者诱导性的表达控制元件，比如使用四环素诱导表达系统、雌激素诱导表达系统、干扰素诱导表达系统、蜕皮激素诱导表达系统、Cumate诱导表达系统、FK506/雷帕霉素诱导表达系统和RU486诱导表达系统等，上述诱导系统各有优缺点。只有生物相容性较好、毒副作用较小的诱导系统才具临床使用价值，比如，四环素诱导表达系统，使用四环素及其类似物诱导，在较低的浓度范围内就可以实现对基因的表达(Tet-ON)或者关闭(Tet-OFF)，而且低浓度的四环素及其类似物对人体的生物相容性和安全性较高，该系统具有较大的临床应用潜力。另外，开发新型的、安全的诱导表达系统也具有重要的应用意义，比如针对HIV-1的TAT蛋白和其R控制元件的诱导表达系统，对HIV-1阳性细胞的基因靶向操作具有一定的应用价值。R元件是存在于病毒基因组长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)上一段DNA序列，该序列编码的RNA正好处于其RNA聚合酶II起始复合体的临位，能够形成一种特殊的高级结构TAR，该特殊RNA结构能够与HIV-1编码的蛋白TAT结合，控制病毒基因的翻译延伸，利用该DNA控制元件和TAT蛋白，可以实现对基因的控制性表达，应用于HIV-1阳性细胞的基因表达。由于DNA或者RNA等属于大分子物质，而传统的小分子药物递送的手段则无法准确高效的递送到细胞内，如果不用病毒介导的基因导入，则需要开发新型非病毒载运技术用于细胞内递送，这就需要特殊的载运载体和靶向分子技术，这是该类药物的一个关键所在。而使用脂质体纳米技术或者非脂质体阳离子纳米技术进行pDNA/RNA药物的递送，目前存在靶向效率低、细胞吸收率低、非整合型DNA/RNA半衰期短、表达效率低的缺点，尤其是阳离子纳米颗粒技术，还具有较高的肝肾毒性等缺点，需要作技术上的进一步提高和优化。但是其具有安全性高、制作成本相对病毒较低、利于工业化规模制造、可以冻干储运等优点，因这些药物相对病毒类载体，具有临床门槛低、改进余地大、容易大规模商业化生产的优点。目前针对DNA、RNA和蛋白等大生物分子的输送，主要采用病毒、脂质体和纳米聚合物等手段。其中脂质体的生物相容性好、装载量大、毒性低、技术较为成熟的优良特性，目前发展了多种脂质体靶向输送方法，包括温敏型、免疫型、pH敏感型、PEG修饰长循环脂质体、柔性脂质体等。上述类型脂质体各有其优点，而现实使用时常将几种技术方法结合使用，增加脂质体的优良特性。该脂质体输送技术应用于非病毒介导的DNA等大分子的细胞靶向输送，具有较大的技术发展空间和应用潜力，有望用于相关药物分子的靶向输送。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术旨在提供一种能够实现特异性切割、可控表达、安全有效的多重基因打靶系统，为艾滋病等病毒类感染疾病的基因治疗奠定基础。为实现上述目的，本专利技术首先提供了一种可控性HIV-1基因组靶向编辑系统。一种可控性HIV-1基因组靶向编辑系统，包括运用高特异性spCAS9(spCAS9-HF1，含N497A/R661A/Q695A/Q926A突变的spCAS9)(Nature.2016Jan28；529(7587):490-5.doi:10.1038/nature16526.)或其他spCAS9编辑酶的改进版本的表达质粒，该控制系统可以应用于其他编本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可控性HIV‑1基因组靶向编辑系统，其特征在于，包括表达可控的编辑酶，搭配多重导引RNA(gRNA)；具体地，所述质粒系统对编辑酶的表达添加了控制元件，使编辑酶的表达或者由LTR启动子和TAT蛋白调控表达，或者由内置哺乳动物源的强启动子和HIV‑1的R元件组成的嵌合启动子控制其表达，或者由内置哺乳动物强启动子和TetO组成的嵌合启动子控制表达；其特征在于，所述编辑酶表达质粒包括如下质粒：p1、p2、p3、p7、p8、p10、p11和p13；所述gRNA表达质粒包括如下质粒：p4、p5、p9、p12、p14和p15。所述多重gRNA指的是针对HIV‑1基因组多个位点和/或CCR5的编码框基因组序列设计的靶向序列。其特征在于，所述多重gRNA表达载体中含有序列表中Seq ID No.1‑5的序列中的至少2种。所述gRNA表达质粒包括如下质粒：p4、p5、p9、p12、p14和p15。所述编辑酶、gRNA共表达质粒包括如下质粒：p6‑1、p6‑2和p6‑3；所述p1的序列如序列表中Seq ID No.7所示，p5的序列如序列表中Seq ID No.20所示，p6‑1的序列如序列表中Seq ID No.8所示，p7的序列如序列表中Seq ID No.9所示，p6‑3和p15的五重gRNA表达序列如Seq ID No.21所示。...

【技术特征摘要】
1.一种可控性HIV-1基因组靶向编辑系统，其特征在于，包括表达可控的编辑酶，搭配多重导引RNA(gRNA)；具体地，所述质粒系统对编辑酶的表达添加了控制元件，使编辑酶的表达或者由LTR启动子和TAT蛋白调控表达，或者由内置哺乳动物源的强启动子和HIV-1的R元件组成的嵌合启动子控制其表达，或者由内置哺乳动物强启动子和TetO组成的嵌合启动子控制表达；其特征在于，所述编辑酶表达质粒包括如下质粒：p1、p2、p3、p7、p8、p10、p11和p13；所述gRNA表达质粒包括如下质粒：p4、p5、p9、p12、p14和p15。所述多重gRNA指的是针对HIV-1基因组多个位点和/或CCR5的编码框基因组序列设计的靶向序列。其特征在于，所述多重gRNA表达载体中含有序列表中SeqIDNo.1-5的序列中的至少2种。所述gRNA表达质粒包括如下质粒：p4、p5、p9、p12、p14和p15。所述编辑酶、gRNA共表达质粒包括如下质粒：p6-1、p6-2和p6-3；所述p1的序列如序列表中SeqIDNo.7所示，p5的序列如序列表中SeqIDNo.20所示，p6-1的序列如序列表中SeqIDNo.8所示，p7的序列如序列表中SeqIDNo.9所示，p6-3和p15的五重gRNA表达序列如SeqIDNo.21所示。2.根据权利要求1所述的可控性HIV-1基因组编辑系统，所述带有5’-和3’-LTR的质粒系统能够整合基因组，其对基因组的整合依赖于细胞内所感染的HIV-1活病毒。3.一种用于输送权利要求1-2任一所述编辑系统的靶向载运系统，其特征在于，所述脂质体主要由以下组分制备而成：二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC：胆固醇：多肽-PEG-磷脂质量比＝20-70:10-30:0.0001-2；或者，二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC：二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC：1,2-二油酰基磷脂酰胆碱DOPC：胆固醇：多肽-PEG-磷脂的摩尔比＝5:1:0.5-3:0.5-2:0.0001-0.5。4.根据权利要求1-3所述的载运系统，其特征在于，所述载运系统含有PEG化的靶向脂质体，PEG为双功能性的，除了共价连接磷脂成分外，还共价偶联了特异的靶向多肽；所述靶向多肽包括单靶点多肽和多靶点多肽中的任一种或几种组合；所述单靶点多肽包括抗CD4多肽aCD4或aCD4scFV、抗CCR5多肽a...

【专利技术属性】
技术研发人员：李因传，
申请(专利权)人：李因传，
类型：发明
国别省市：天津,12