猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT‑PCR检测方法及其应用技术

本发明专利技术属于微生物检测领域，涉及猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒的检测，具体涉及猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT‑PCR检测方法及其应用。检测方法包括以下步骤：猪Delta冠状病毒上、下游引物和猪流行性腹泻病毒上、下游引物的设计；双重实时荧光体系的准备；双重实时荧光检测方法的实施。作为同时检测猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒的应用。本发明专利技术建立的检测方法，能够同时快速、特异性的检测到PEDV和PDCoV两种病毒，具有良好的特异性、重复性和敏感性，为临床诊断和防治PEDV和PDCoV提供了有力的技术支持，也为该类疫病的分子流行病学和防控研究奠定了基础。

Porcine Delta coronavirus and porcine epidemic diarrhea virus RT double fluorescent PCR detection method and its application

The invention belongs to the field of microbial detection, detection of porcine Delta coronavirus and to porcine epidemic diarrhea virus, in particular to porcine Delta coronavirus and porcine epidemic diarrhea virus RT double fluorescent PCR detection method and its application. The detection method comprises the following steps: Design of porcine Delta coronavirus upstream and downstream primers and porcine epidemic diarrhea virus upstream and downstream primers; dual real-time system; implementation of dual real-time detection method. Application as a simultaneous detection of porcine Delta coronavirus and porcine epidemic diarrhea virus. The detection method of the invention can be established, at the same time, the rapid detection of specific to PEDV and PDCoV two kinds of viruses, with specificity, good repeatability and sensitivity, providing strong technical support for the clinical diagnosis and treatment of PEDV and PDCoV, but also lay a foundation for the research and control of molecular diseases epidemic learn.

【技术实现步骤摘要】
猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法及其应用
本专利技术属于微生物检测领域，涉及猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒的检测，具体涉及猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法及其应用。
技术介绍
猪Delta冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus,PDCoV)是一种新型猪冠状病毒，属于冠状病毒科、冠状病毒属成员，是具有囊膜的单股正链RNA病毒。2012年，香港学者Woo首次报道在猪粪便中检测到PDCoV，同时在其他哺乳动物和鸟类上也检测到该病毒。至2014年初，美国俄亥俄州仔猪腹泻病料中也检测到PDCoV。PDCoV患病猪临床症状为严重腹泻、呕吐、脱水、仔猪致死率高剖检变化可见小肠上皮细胞有损伤。随后在加拿大、韩国、越南、老挝等国家也报道检测到PDCoV，其阳性检出率高达25％。2015年对我国华东地区猪场进行检测，也发现该病毒，说明我国大陆猪群中也存在PDCoV的感染。在随后的报道中，安徽、广西、河北、江苏等地区病料检测结果显示PDCoV已在我国至少存在了11年。猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的猪腹泻类疾病，各种年龄段、各个品种的猪均可感染此病。1971年首次在英国发现PED；我国于1976年首次报道了该病，在1980年第一次证实分离到PEDV，到2000年该病已经在全国范围内开始流行。特别是从2010年起，PED在我国的猪群中呈暴发性流行，给我国的养猪业带来了极大的经济损失；2013年春PED在美国首次暴发，哺乳仔猪的发病率高达90％；随后，PEDV也在加拿大和墨西哥等地流行。目前PED给世界范围内各国养猪业带来不可计数的经济损失，PEDV已成为危害全球养猪业发展的重要病原。本实验室从2014年10月起，对来自河南省不同地区的仔猪、母猪的疑似样品进行PDCoV和PEDV病原检测，发现部分猪场PDCoV和PEDV混合感染且情况严重。临床上PDCoV感染的仔猪主要表现为水样腹泻、呕吐和脱水等症状，和PED的临床症状非常相似，单靠临床症状和剖检病理变化很难区分这两种疾病。因此建立快速检测PEDV和PDCoV的方法对确诊这两种疫病显得尤为重要。目前，针对PEDV的诊断方法很多，如病毒的分离鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、单克隆抗体技术、SYBRGreenI荧光定量RT-PCR方法、常规PCR方法以及核酸探针技术等。但是，这些诊断方法存在或敏感性、特异性，或操作技术复杂、费时费力等缺点，且诊断结果滞后，如病毒分离鉴定费时费力耗时长、血清学方法敏感性低不能早期检测、普通PCR技术不能对病毒定量等缺点。新发的PDCoV检测方法还比较少见，2015年AnilThachil等建立了间接ELISA方法用于血清中PDCoV的追溯性检测，结果显示PDCoV早在2014年就在美国猪群中存在。逢凤娇等建立的PDCoV常规RT-PCR检测方法，最低检测限为4.05×103拷贝/μL。然而不能满足临床上PEDV和PDCoV混合感染的快速检测。PDCoV和PEDV都是目前引起仔猪腹泻的主要病原，都能够引起仔猪不同程度的腹泻，在猪群中具有传播快、感染率高、流行范围广等特点，每年给养猪业造成了巨大的经济损失。特别是PEDV和PDCoV混合感染情况比较普遍，通过观察临床症状和病理变化很难区分这两种病原，给临床检测和控制这两种疾病造成了很大的困难。
技术实现思路
本专利技术为解决快速检测PEDV和PDCoV这两种疫病混合感染的技术难题，根据GenBank中收录的PDCoV毒株HKU15-155(JQ065043)M基因和PEDV毒株CHLY-09(KF476053)ORF3基因序列设计了特异性引物，在此基础上建立并完善了能同时准确检测PDCoV和PEDV的双重SYBRGreenI荧光RT-PCR检测方法，公开了猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法及其应用。为解决上述技术难题，本专利技术采用以下技术方案：猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法，包括以下步骤：(1)猪Delta冠状病毒上、下游引物和猪流行性腹泻病毒上、下游引物的设计；(2)双重实时荧光体系的准备；(3)双重实时荧光检测方法的实施。所述步骤(1)中，猪Delta冠状病毒的上游引物如SEQIDNO：1所示，猪Delta冠状病毒的下游引物如SEQIDNO：2所示；猪流行性腹泻病毒的上游引物如SEQIDNO：3所示，猪流行性腹泻病毒的下游引物如SEQIDNO：4所示。所述步骤(2)中，双重实时荧光体系为PremixExTaqTMI13μL，25pmol/μL的猪Delta冠状病毒的上游引物、25pmol/μL的猪Delta冠状病毒的下游引物各0.5μL，25pmol/μL的猪流行性腹泻病毒的上游引物、25pmol/μL的猪流行性腹泻病毒的下游引物各0.5μL，样品模板2μL，用ddH2O补足25μL体系。所述步骤(3)中双重实时荧光检测方法为，将步骤(2)中的双重实时荧光体系，置于荧光定量PCR仪中，设定PCR程序为95℃30s，94℃5s，55℃40s，72℃40s，共进行35个循环，通过溶解曲线确定猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒的检测结果。猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法，作为同时检测猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒的应用。本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术利用双重荧光RT-PCR检测方法，对采集于河南不同猪场的198份腹泻仔猪样品进行检测，大致掌握猪流行性腹泻和新发猪冠状病毒病在河南地区的感染情况。为检测PEDV和PDCoV提供了一种新的方法，同时为规模化猪场净化PEDV和PDCoV这两种病毒提供了方法，也为PEDV和PDCoV分子流行病学调查、早期诊断、诊断试剂盒的研制与开发奠定了理论依据和技术支持。本专利技术的公开为临床诊断和防治PEDV和PDCoV提供了有力的技术支持，也为该类疫病的分子流行病学和防控研究奠定了基础。2、本专利技术成功的建立了PDCoV和PEDV双重SYBRGreenI荧光RT-PCR检测方法，能够同时快速、特异性的检测到PEDV和PDCoV这两种病毒，该方法具有良好的特异性、重复性和敏感性，运用该方法对临床198份仔猪腹泻样品进行检测，结果与单重荧光定量RT-PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一致，符合率为100％。3、本专利技术从2015年1月至2016年3月从河南省不同地区的腹泻猪群中收集的样品，应用所建立的双重荧光PCR方法对其进行PDCoV和PEDV检测，PDCoV阳性率为20.7％，PEDV阳性率为29.8％，PEDV和PDCoV混合感染阳性率为8.6％，其检测结果可以反映出河南省部分猪场存在PDCoV和PEDV感染。附图说明图1为PDCoVM基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M:DL2000Maker；1：PDCoVM基因PCR扩增结果；2：阴性对照。图2为PEDVORF3基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳，其中M:DL2000Maker；1：PEDVORF3基因PCR扩增结果；2：阴性对本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT‑PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）猪Delta冠状病毒上、下游引物和猪流行性腹泻病毒上、下游引物的设计；（2）双重实时荧光体系的准备；（3）双重实时荧光检测方法的实施。

【技术特征摘要】
1.猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）猪Delta冠状病毒上、下游引物和猪流行性腹泻病毒上、下游引物的设计；（2）双重实时荧光体系的准备；（3）双重实时荧光检测方法的实施。2.如权利要求1所述的猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中，猪Delta冠状病毒的上游引物如SEQIDNO：1所示，猪Delta冠状病毒的下游引物如SEQIDNO：2所示；猪流行性腹泻病毒的上游引物如SEQIDNO：3所示，猪流行性腹泻病毒的下游引物如SEQIDNO：4所示。3.如权利要求1所述的猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中，双重实时荧光体系为SYBR®PremixExTaqTMI13µ...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡慧，魏法山，张利卫，曹贝贝，王留留，丁庆文，袁婷婷，张秀梅，高广娟，黄丹妮，冯伟民，张艺璠，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41