卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ‑3及其筛选方法和应用，所述酸适配体WYZ‑3的序列为：5’‑AGCTGCTATACTAGCTAAAGACCTGAGGTCCTTTGACGTTCCAGGTAGACTTGAACCGTACCGTAGCGATAGCTAGCTT‑3’，它的筛选方法为基于SELEX筛选技术，以卵巢浆液性癌细胞SKOV3和正常卵巢上皮细胞IOSE作为反筛细胞，以卵巢粘液性癌细胞3AO为正筛细胞，筛选出与卵巢粘液性癌细胞3AO特异性结合的核酸适配体，它具有高特异性、高亲和力、可体外合成及修饰、化学性质稳定、药代动力学性质佳、无免疫原性等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3及其筛选方法和应用。
技术介绍
卵巢粘液性癌对化疗药物的敏感性差且治疗预后效果常不佳。因此，需要采用更多有针对性的研究以寻求更好提高卵巢粘液性癌患者生存率的治疗方法。在卵巢癌的诊断中，采用的主要方法包括B超、CT、MRI、腹腔镜检查和血清肿瘤标志物检查，这些诊断方法主要是基于形态学标准，缺乏与卵巢粘液性癌相关的特异性标志。另外，所有卵巢癌通常采用相同的治疗方法，即手术治疗联合化疗的综合治疗策略，这些治疗方法针对性不够理想。基于单克隆抗体技术，近年来发展的靶向治疗策略在提高卵巢粘液性癌患者生存率方面展现出独特优势，但是抗体本身所具有的一些缺陷，如免疫原性、不稳定性、批次间的差异性等，使其在临床上的实际应用中具有一定的局限性。综上所述，找到卵巢粘液性癌细胞的特异性识别分子，在肿瘤的诊断和治疗中具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有高特异性和高亲和力的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3及其筛选方法和应用。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3，它的序列如下：5’-AGCTGCTATACTAGCTAAAGACCTGAGGTCCTTTGACGTTCCAGGTAGACTTGAACCGTACCGTAGCGATAGCTAGCTT-3’所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的筛选方法，基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术(指数富集配体的系统进化技术)，以卵巢浆液性癌细胞SKOV3和正常卵巢上皮细胞IOSE作为反筛细胞，以卵巢粘液性癌细胞3AO为正筛细胞，筛选出与卵巢粘液性癌细胞3AO特异性结合的核酸适配体。所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的应用，在制备检测卵巢粘液性癌的试剂盒、分子探针或靶向介质中的应用。所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的应用，在制备治疗卵巢粘液性癌的靶向治疗探针中的应用。所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的应用，在制备治疗卵巢粘液性癌药物中的应用。所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的应用，在研究卵巢粘液性癌细胞表面蛋白中的应用。所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的应用，在卵巢肿瘤组织病理染色中、分离卵巢粘液性癌细胞中以及在卵巢肿瘤相关的体内分子成像中的应用。较之现有技术而言，本专利技术的优点在于：1.核酸适配体WYZ-3具有高特异性的优点，它只特异性识别卵巢粘液性癌细胞3AO，对其他卵巢癌细胞、正常卵巢上皮细胞等不具有或者具有较弱的识别功能。2.核酸适配体WYZ-3还具有高亲和力、可体外合成及修饰、化学性质稳定、药代动力学性质佳、无免疫原性等特点。3.核酸适配体在肿瘤细胞生物学、临床实验诊断学、分子成像新技术开发以及靶向治疗方面具有广阔的应用前景和重要的学术价值。4.核酸适配体WYZ-3的合成成本较抗体制备的成本低，且周期短，重现性好。附图说明图1为利用流式细胞术分析测定核酸适配体WYZ-3结合卵巢粘液性癌细胞3AO的解离常数绘制曲线。解离常数Kd＝30.8±10.6nM。在图1中，横坐标为DNA浓度(nM)，纵坐标为平均荧光强度。图2为利用流式细胞术分析核酸适配体WYZ-3对卵巢粘液性癌细胞3AO的偏移。在图2中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为WYZ-3，虚线为未经筛选的单链DNA文库。图3为利用流式细胞术分析核酸适配体WYZ-3对卵巢浆液性癌细胞SKOV3的偏移。在图3中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为WYZ-3，虚线为未经筛选的单链DNA文库。图4为利用流式细胞术分析核酸适配体WYZ-3对正常卵巢上皮细胞IOSE的偏移。在图4中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为WYZ-3，虚线为未经筛选的单链DNA文库。图5为核酸适配体WYZ-3的空间结构示意图。具体实施方式下面结合说明书附图和实施例对本
技术实现思路
进行详细说明：一种卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3，它的序列如下：5’-AGCTGCTATACTAGCTAAAGACCTGAGGTCCTTTGACGTTCCAGGTAGACTTGAACCGTACCGTAGCGATAGCTAGCTT-3’所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3，在37℃，0.137MNa+，0.001MMg2+的生理条件下，其具有特征性的茎环结构，其空间结构如下：所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3，对所述核酸适配体WYZ-3的5’端或3’端进行FITC、氨基、生物素或地高辛化学修饰。所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的筛选方法，基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，以卵巢浆液性癌细胞SKOV3和正常卵巢上皮细胞IOSE作为反筛细胞，以卵巢粘液性癌细胞3AO为正筛细胞，筛选出与卵巢粘液性癌细胞3AO特异性结合的核酸适配体。利用卵巢粘液性癌细胞3AO为筛选靶细胞，以与之相对应的卵巢浆液性癌细胞SKOV3以及正常卵巢上皮细胞IOSE作为反筛细胞，筛选除去DNA寡核苷酸文库中与卵巢浆液性癌细胞、正常卵巢上皮细胞非特异性结合的部分，保证筛选得到的核酸适配体可以特异性的结合卵巢粘液性癌细胞3AO。另外，采用标准的Cell-SELEX筛选方法，保持筛选细胞的形态和活性完好，保证细胞表面生物大分子更加接近于生物体内的分子构象。所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的筛选方法，它包括以下步骤：(1)准备以下序列所示的单链DNA文库：单链DNA文库：5’-AGCTGCTATACTAGCTAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCGTAGCGATAGCTAGCTT-3’；(2)SKOV3细胞反筛：将步骤(1)准备的文库与SKOV3细胞孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清；(3)IOSE细胞反筛：将步骤(2)所得上清与IOSE细胞孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清；(4)3AO细胞正筛：将步骤(3)所得的上清与3AO细胞孵育，孵育完成后，弃上清液；洗涤3AO细胞并将3AO细胞刮下后，转移到EP管中进行加热变性，之后离心分离收集上清液；(5)PCR富集：步骤(4)所得的上清液进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；其中PCR扩增所用的引物为：引物Fup:5’-FAM-AGCTGCTATACTAGCTAAAG-3’；引物Ldown:5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-spacerC9-AAGCTAGCTATCGCTACGG-3’；TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-spacerC9使两条引物的链长不一样，便于PCR扩增产物的变性电泳分离。(6)单链DNA纯化：将PCR扩增产物进行变性解链后，变性电泳分离，纯化收集FAM标记的ssDNA；(7)核酸适配体循环筛选：将步骤(6)所得的ssDNA作为下一轮筛选的次级文库，并重复步骤(2)～(6)的筛选过程。实施例一：核酸适配体WYZ-3的筛选：所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的筛选方法，它包括以下步骤：(1)筛选文库的准备：委托生工生物工程股份本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ‑3，其特征在于：它的序列如下：5’‑AGCTGCTATACTAGCTAAAGACCTGAGGTCCTTTGACGTTCCAGGTAGACTTGAACCGTACCGTAGCGATAGCTAGCTT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3，其特征在于：它的序列如下：5’-AGCTGCTATACTAGCTAAAGACCTGAGGTCCTTTGACGTTCCAGGTAGACTTGAACCGTACCGTAGCGATAGCTAGCTT-3’。2.根据权利要求1所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3，其特征在于：在37℃，0.137MNa+，0.001MMg2+条件下其空间结构如下：3.根据权利要求1所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3，其特征在于：对所述核酸适配体WYZ-3的5’端或3’端进行FITC、氨基、生物素或地高辛化学修饰。4.根据权利要求1-3任意一项所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的筛选方法，其特征在于：基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，以卵巢浆液性癌细胞SKOV3和正常卵巢上皮细胞IOSE作为反筛细胞，以卵巢粘液性癌细胞3AO为正筛细胞，筛选出与卵巢粘液性癌细胞3AO特异性结合的核酸适配体。5.根据权利要求4所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的筛选方法，其特征在于：它包括以下步骤：(1)准备以下序列所示的单链DNA文库：单链DNA文库：5’-AGCTGCTATACTAGCTAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCGTAGCGATAGCTAGCTT-3’；(2)SKOV3细胞反筛：将步骤(1)准备的文库与SKOV3细胞孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清；(3)IOSE细胞反筛：将步骤(2)所得上清与IOSE细胞孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清；(4)3AO细胞正筛：将步骤(3...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴冬，黄慧娟，何春妮，林朝雅，
申请(专利权)人：吴冬，
类型：发明
国别省市：福建;35