一株能分泌识别亚甲基蓝的单克隆抗体的单克隆细胞株C4及其应用制造技术

一株能分泌识别亚甲基蓝的单克隆抗体的单克隆细胞株C4及其应用，属于免疫化学技术领域。本发明专利技术提供的单克隆细胞株C4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 12026。此单克隆细胞株C4分泌的单克隆抗体能够特异性识别亚甲基蓝，特异性好，且灵敏度高，半数抑制浓度（IC50）为21.13 ng/mL；用此单克隆抗体能够用于建立亚甲基蓝的免疫检测技术。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株能分泌识别亚甲基蓝的单克隆抗体的单克隆细胞株C4及其应用，属于免疫化学

技术介绍
亚甲基蓝属于噻嗪类染料，自孔雀石绿被明令禁止用于水产养殖中后，其替代品亚甲基蓝的残留问题引起广泛关注和重视。亚甲基蓝最初开始用于尿道感染和疟疾的防治，随着研究不断地深入，有研究发现亚甲基蓝能杀死肿瘤细胞并对肿瘤细胞有较高的亲和性，因此亚甲基蓝经放射性同位素标记后用来诊断、定位和治疗多种肿瘤。亚甲基蓝同时具有氧化性和还原性，在临床上可作为解毒剂用于氰化物和亚硝酸盐等药物中毒。由于亚甲基蓝在水溶液中呈离子型状态，将与周边微生物的酶系统竞争氢离子，导致微生物酶失活致死。故亚甲基蓝还在兽医领域特别是水产养殖中用作消毒剂。有研究表明，亚甲基蓝还对一些鱼病如斜管虫病，小爪虫，水霉病等有较好的疗效。因此，当一些三苯甲烷类染料如孔雀石绿和结晶紫被明确禁止用于水产养殖后，亚甲基蓝作为替代品成为养殖户们亲睐的对象。除了消毒剂和鱼病预防外，亚甲基蓝还可在水产品运输过程中作为抗真菌剂使用以降低死亡率。亚甲基蓝的毒性低于孔雀石绿，然而在水产养殖过程中任何对亚甲基蓝的不合理使用，都可能造成亚甲基蓝的蓄积，另外随着染料的广泛运用，作为阳离子染料的亚甲基蓝随着废水大量进入周边水域，造成环境中亚甲基蓝浓度超标，当人或动物长期暴露在高浓度的亚甲基蓝环境中时，容易引起中毒现象，毒副作用有致突变，红细胞形态改变或贫血，坏死性脓肿等，严重时可致死。因此，包括美国，日本，欧盟在内的国家或组织不允许亚甲基蓝用于水产养殖中。在我国，亚甲基蓝由于其价格低廉，疗效明确，养殖户对其毒副作用了解较少，亚甲基蓝在水产养殖中作为消毒剂及孔雀石绿的替代品被广泛运用，因此其残留问题不容小觑，对其残留的检测技术研究对我国的食品安全及出口贸易具有重要意义。我国虽然还未出台相关法律法规，但是检测技术的研究是监督工作的先驱，面对国际贸易的技术壁垒，对亚甲基蓝及其代谢残留检测技术的研究，尤其是快速简便筛查技术的研究刻不容缓。已发表的文献中对亚甲基蓝的检测技术仍停留在仪器方法上，如液相色谱技术，毛细管电泳技术和离子色谱法，检测器一般为质谱或光学检测器，前处理技术有液液萃取及固相萃取技术。目前，对亚甲基蓝的主流检测手段主要是高效液相色谱串联质谱法，只是在检测器以及样品前处理手段上如萃取，净化等步骤上略有不同。对水产品中亚甲基蓝的免疫分析技术研究基本处于空白阶段。建立亚甲基蓝的免疫检测技术，首先要获得特异性识别亚甲基蓝的单克隆抗体。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种单克隆细胞株C4，其能够产生特异性识别亚甲基蓝的单克隆抗体，能够用于建立亚甲基蓝的免疫检测技术。本专利技术的技术方案：一株能分泌识别亚甲基蓝的单克隆抗体的单克隆细胞株C4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12026。一种识别亚甲基蓝的特异性单克隆抗体，其由保藏编号为CGMCCNo.12026的单克隆细胞株C4分泌产生。所述的识别亚甲基蓝的特异性单克隆抗体的应用，在制备检测亚甲基蓝的免疫工具中的应用。所述的识别亚甲基蓝的特异性单克隆抗体的应用，在检测鱼肉中亚甲基蓝的应用。本专利技术的有益效果：由单克隆细胞株C4产生的特异性单克隆抗体能够特异性识别亚甲基蓝；且灵敏度好，半数抑制浓度（IC50）为21.13ng/mL；为研制食品中亚甲基蓝检测的免疫工具提供了原料，例如酶联免疫技术和免疫层析试纸条。生物材料样品保藏：本专利技术提供的杂交瘤细胞株C4，分类命名为单克隆细胞株，该细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2016年1月20日，保藏编号为CGMCCNo.12026。附图说明图1亚甲基蓝单抗的标准曲线。图2完全抗原的紫外鉴定结果。具体实施方式本专利技术提供了单克隆细胞株C4及其分泌的抗亚甲基蓝的特异性单克隆抗体。下面结合具体实施方式对本专利技术做进一步的说明，实施例中如无特殊说明均为常规方法。实施例1单克隆细胞株C4的制备1、小鼠免疫和抗血清筛选选择半抗原（MB-HS）通过活化酯法分别与血蓝蛋白（KLH）和卵清蛋白（OVA）偶联，形成免疫原（MB-HS-KLH）和包被原（MB-HS-OVA）。首免采用完全佐剂和免疫原1︰1体积混合，以皮下免疫方式免疫BALB/c小鼠，免疫间隔时间4周，六免后7-10d，以包被原包被酶标板，采用间接竞争酶联免疫法测定血清的效价和抑制，选择效价高并抑制好的小鼠进行融合。其中，半抗原为亚甲基蓝衍生物，半抗原的结构为：2、细胞融合小鼠抗血清评价后第21天，选择符合要求的小鼠进行腹腔冲刺免疫。具体过程如下：将免疫原用生理盐水稀释至200μL体积，冲免剂量为最后一次加强免疫的剂量的一半，将稀释好的免疫原注入1mL注射器，从小鼠左侧腹腔缓慢注入小鼠体内。小鼠冲免3天后，采用断颈的方式处死小鼠，并迅速放入100mL75%酒精中,小鼠在酒精中浸泡5-10min后转移到超净工作台取出脾脏，放置在200目不锈钢筛网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，并不断用RPMI1640培养基进行冲洗，将脾细胞悬浮液收集到50mL离心管中，1200r/min离心8min，弃上清，轻轻吹打离心管底部以分散细胞，加入RPMI1640培养基重悬脾细胞，并转移到新的50mL离心管中。重复离心三次后加入10mLRPMI1640培养基，混匀，取出其中的100μL稀释1000倍进行计数，余下的备用。脾细胞收集好后，开始收集处于对数生长期的瘤细胞。瘤细胞与脾细胞按计数比1︰2-10比例混合均匀，1200r/min离心8min，弃上清，用食指轻轻弹打离心管底部使细胞分散均匀，准备融合：第1min内，将预热的1mLPEG缓慢贴壁匀速滴加到混合细胞中，边加边轻轻摇动离心管；第2min内，将离心管握在手中，静置；第3-4min，以1mL/min的速度缓慢滴加2mL的RPMI1640，边加边摇动离心管；第5-6min内，以1mL/30s的速度缓慢滴加4mL的RPMI1640，边加边摇；第7min内，以1mL/10s的速度加入RPMI1640。最后加入RPMI1640至20mL,将离心管用封口膜封好放到培养箱中静置5min，800r/min离心8min，弃上清，用食指轻轻弹打离心管底部使细胞分散开来，缓慢加入HAT选择培养基，轻轻混匀后按200μL/孔转移到96孔细胞板中（铺板数量根据细胞数量而定），放在CO2培养箱中培养。细胞融合后第3天进行HAT选择培养基半换液，第6天进行HAT培养基全换液，第7天取细胞上清进行细胞筛选。融合后第7天，根据小鼠抗血清的效价和抑制测定结果，确定细胞筛选所需的包被浓度，进行包板封闭。首先进行细胞阳性的测定，再取出阳性孔的细胞上清，进行抑制测定，抑制测定时需进行适当的稀释使所有孔的OD值尽量都在1.5左右，在96孔板中分别加入一定浓度的亚甲基蓝标准品和标准品稀释液，50μL/孔，按50μL/孔加入稀释好的细胞上清，37℃烘箱温育30min，再按常规ELISA操作方法洗板加入二抗等直至测定吸光值。根据检测结果，挑选抑制较好阳性较高的4-6个孔进行第本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株能分泌识别亚甲基蓝的单克隆抗体的单克隆细胞株C4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 12026。

【技术特征摘要】
1.一株能分泌识别亚甲基蓝的单克隆抗体的单克隆细胞株C4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12026。2.一种识别亚甲基蓝的特异性单克隆抗体，其特征在于：其由保藏编号为CGMCCNo.1202...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡华，彭娟，胥传来，徐丽广，刘丽强，宋珊珊，吴晓玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32