本发明专利技术提供了一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：(1)根据哺乳动物细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列，在所述基因序列上、下游分别加入酶切位点，并在下游添加SV40T‑Antigen核定位序列；基因合成的T7RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因克隆到质粒pUC57中，通过酶切位点连接到pcDNA3.1真核表达载体上，构建得到pcDNA3.1‑RNAP质粒；(3)将待表达基因两端分别加入T7启动子，IRES和T7终止子，然后连接到pUC57载体上，构建得到待表达基因的质粒；(4)将步骤(2)和(3)中得到的质粒作为双质粒共表达系统，以共转染真核细胞，以及表达蛋白。本发明专利技术提高了哺乳表达系统的表达量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组蛋白质制备领域，具体涉及一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法。
技术介绍
目前哺乳动物细胞表达系统，通常采用pCMV启动子进行外源基因的表达，表达量相对原核系统T7启动子普遍低很多，T7启动子表达的蛋白，普遍可达到细胞总蛋白的5-20％甚至更高，并且普通的SDS-PAGE电泳即可检测，而真核表达系统相比差很多，通常都是需要用WB这种高灵敏度的方法进行检测。相对来讲，提高哺乳表达系统的产量具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术中的上述缺陷，本专利技术的主要目的在于提供一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，提高了哺乳表达系统的表达量。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：(1)根据哺乳动物细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列，在所述基因序列上、下游分别加入酶切位点，并在下游添加SV40T-Antigen核定位序列；基因合成的T7RNA聚合酶基因序列如SEQIDNO:1所示；(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因克隆到质粒pUC57中，通过酶切位点连接到pcDNA3.1真核表达载体上，构建得到pcDNA3.1-RNAP质粒；(3)将待表达基因连接到pUC57载体上，构建得到待表达基因的质粒；(4)将步骤(2)和(3)中得到的质粒作为双质粒共表达系统，以共转染真核细胞，以及表达蛋白。作为进一步的优选，所述步骤(1)中，所述T7RNA聚合酶为T7噬菌体RNA聚合酶。作为进一步的优选，所述步骤(1)中，所述核定位序列为SV40T-Antigen核定位序列，Nucleoplasmin核定位序列，EGL-13核定位序列，c-Myc核定位序列或TUS-protein核定位序列中的一种。作为进一步的优选，所述步骤(1)中，所述核定位序列为SV40T-Antigen核定位序列。作为进一步的优选，所述步骤(2)中，所述连接为采用T4DNA连接酶进行连接，所述连接后转化大肠杆菌DH5α，利用氨苄青霉素(Amp)抗性基因筛选阳性克隆，得到pcDNA3.1-RNAP。作为进一步的优选，所述步骤(3)中，所述pUC57载体具有T7启动子、多克隆位点、IRES序列以及T7终止子。作为进一步的优选，所述步骤(3)中，所述pUC57载体从pIRES载体上克隆得到多克隆位点B和IRES序列以及T7终止子。作为进一步的优选，所述克隆方法包括：1)设计含T7启动子序列的上游引物和t7终止子的下游引物来扩增相应序列；2)PCR扩增T7启动子，IRES序列，多克隆位点B，通过引物和Platinum-pfx试剂盒，将pIRES载体的片段克隆到pUC57载体上。作为进一步的优选，所述上游引物T7为：5'TAATACGACTCACTATAGAATTCCGCCCCTCTCC3'，所述下游引物T7为：5'CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTTTACCACATTTGTAGAGGTT3'。作为进一步的优选，所述步骤(4)中，在共转染真核细胞后的培养基中添加α-鹅膏蕈碱。作为进一步的优选，所述步骤(4)中，所述α-鹅膏蕈碱的浓度为10μg/mL。作为进一步的优选，所述真核细胞为真核细胞株293T。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术组建成的T7启动子/RNA聚合酶的载体系统，可应用于外源基因在哺乳类动物细胞中的表达，提高了哺乳表达系统的表达量；并且使用IRES序列以解决T7RNA聚合酶转录没有真核翻译位点的问题。2、本专利技术表达蛋白的方法使用α-鹅膏蕈碱抑制真核细胞中的RNA聚合酶Ⅱ的活性，使转染的基因在真核细胞中只受到T7噬菌体RNA聚合酶转录，转录效率高，表达蛋白量大。3、本专利技术使用双质粒共转染表达系统，一个用于表达T7RNA聚合酶，用来合成外源RNA，一个用于表达待表达外源基因，本专利技术表达效率高，表达量大。附图说明图1为本专利技术实施例1转染真核细胞后48h荧光图。图2为本专利技术实施例3转染真核细胞后48h荧光图。具体实施方式本专利技术通过提供一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，提高了哺乳表达系统的表达量。为了解决上述缺陷，本专利技术实施例的主要思路如下：本专利技术实施例用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：(1)根据哺乳动物细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列，在所述基因序列上、下游分别加入酶切位点，并在下游添加SV40T-Antigen核定位序列；基因合成的T7RNA聚合酶基因序列如SEQIDNO:1所示；(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因克隆到质粒pUC57中，通过酶切位点连接到pcDNA3.1真核表达载体上，构建得到pcDNA3.1-RNAP质粒；(3)将待表达基因连接到pUC57载体上，构建得到待表达基因的质粒；(4)将步骤(2)和(3)中得到的质粒作为双质粒共表达系统，以共转染真核细胞，以及表达蛋白。所述步骤(1)中，使用T7RNA聚合酶基因序列(Geneabank登录号Am946981.1)在不改变野生型T7RNA聚合酶氨基酸序列的前提下，将每个氨基酸的密码子替换成哺乳动物细胞中使用频率最高或次高的，同时避免局部出现连续多个的GC、AT，并保证G+C含量在30％-70％之间。核定位序列(Nuclearlocalizationsignal)是蛋白质的一个结构域，通常为一短的氨基酸序列，它能与入核载体相互作用，使蛋白能被运进细胞核。蛋白和mRNA在细胞核和细胞质之间的运输称为入核和出核。本专利技术实施例一般选用SV40T-Antigen核定位序列。所述双质粒共转染表达系统，一个用于表达T7RNA聚合酶，用来合成外源RNA，一个用于表达待表达外源基因。所述共转染时，通常将两质粒按一定摩尔比混合。为了让本专利技术之上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举数实施例，来说明本专利技术所述之用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统表达蛋白的方法。实施例1密码子优化使用大肠杆菌BL21T7RNA聚合酶基因序列(Geneabank登录号Am946981.1)在不改变野生型T7RNA聚合酶氨基酸序列的前提下，将每个氨基酸的密码子替换成人细胞中使用频率最高或次高的，同时避免局部出现连续多个的GC、AT，并保证G+C含量在30％-70％之间。最后在这段基因上游加入HindIII，下游依次添加了SV40T-Antigen核定位序列和EcoRI酶切位点。片段长度为2600bp左右，序列见序列表。密码子优化及全基因合成均在武汉金开瑞完成。待优化序列生成后，通过VisualGeneDeveloper软件，进一步确认优化前后mRNA二级结构及自由能。质粒构建构建T7-RNAP的真核表达载体：将上述合成的基因克隆到质粒pUC57中，提取质粒备用，通过HindIII和EcoRI酶切位点双酶切连接到pcDNA3.1真核表达载体上，取5μgEcoRI/HindIII酶切过的pUC57-T7RNAP与约100ngpcDNA3.1经过同样双酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)根据哺乳动物细胞偏爱密码子优化原始T7 RNA聚合酶基因序列，在所述基因序列上、下游分别加入酶切位点，并在下游添加核定位序列；基因合成的T7 RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；(2)将所述合成的T7 RNA聚合酶基因克隆到质粒pUC57中，通过酶切位点连接到pcDNA3.1真核表达载体上，构建得到pcDNA3.1‑RNAP质粒；(3)将待表达基因连接到pUC57载体上，构建得到待表达基因的质粒；(4)将步骤(2)和(3)中得到的质粒作为双质粒共表达系统，以共转染真核细胞，以及表达蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)根据哺乳动物细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列，在所述基因序列上、下游分别加入酶切位点，并在下游添加核定位序列；基因合成的T7RNA聚合酶基因序列如SEQIDNO:1所示；(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因克隆到质粒pUC57中，通过酶切位点连接到pcDNA3.1真核表达载体上，构建得到pcDNA3.1-RNAP质粒；(3)将待表达基因连接到pUC57载体上，构建得到待表达基因的质粒；(4)将步骤(2)和(3)中得到的质粒作为双质粒共表达系统，以共转染真核细胞，以及表达蛋白。2.根据权利要求1所述的用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述T7RNA聚合酶为T7噬菌体RNA聚合酶。3.根据权利要求1所述的用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述核定位序列为SV40T-Antigen核定位序列，Nucleoplasmin核定位序列，EGL-13核定位序列，c-Myc核定位序列或TUS-protein核定位序列中的一种。4.根据权利要求1所述的用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述pUC57载体具有T7启动子、多克隆位点、IRES序列以及T7终止子。5.根据权利要求1或4所述的用T7噬菌体RNA聚合酶和T7...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈鹤霄，华权高，马峰，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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