本发明专利技术提供了一种A型禽流感重组噬菌体疫苗及其构建方法，所说的疫苗以重组噬T7菌体为抗原，所说的重组T7噬菌体表面表达有氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的H5亚型禽流感病毒M2蛋白膜外区23肽(M2e)，所说的M2e由两拷贝的M2e基因插入T7噬菌体P10B基因下游表达获得。本发明专利技术具有如下技术效果：(1)用T7噬菌体载体制备的重组噬菌体疫苗能够克服M2e自身免疫原性较弱的不足，有效的提高免疫原性，刺激机体产生更高水平的抗体。(2)M2蛋白在禽流感病毒不同亚型之间具有保守型，该重组噬菌体疫苗有望成为“通用型”禽流感疫苗的情景。(3)由于T7噬菌体易于培养、便于纯化，用于生产基因工程疫苗具有多种优势，本发明专利技术制备的A型禽流感重组噬菌体味疫苗便于大规模生产、成本低廉。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及T7噬菌体展A型禽流感病毒M2蛋白膜外区23肽的重组噬菌体构建及应用，属于分子生物
技术介绍
禽流感(Avian Inlfuenza, Al)是由A型流感病毒引起的禽类(家禽和野禽)的一种从呼吸系统到严重全身性败血症等的多种疾病综合症。该病被世界卫生组织规定为A 类传染病，也被我国列为一类动物疾病。一般来说，不同的流感病毒有着不同的宿主特异性，即禽流感病毒很难感染人类，人流感病毒也很难感染禽类。然而1997年香港从18个病人体内分离出高致病性H5W禽流感，第一次明确禽类流感病毒未经过中间宿主就跨越物种屏障直接传染给人。禽流感病毒(Jvi.an infuenza virus, AIV)为正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒，病毒颗粒呈球形或多形态。其基因组是长约13. 6Kb的8个分节段的单股负链RNA，共编码10个多肽，分别为血凝素HA，神经氨酸酶NA，核蛋白NP，RNA多聚酶的复合物PBl、PB2、 PA，基质蛋白M1、M2以及非结构蛋白NSl和NS2。病毒RNA片段通过与核蛋白相结合进行病毒的复制。病毒聚合酶PA、PB1和PB2聚合形成核蛋白复合体(RNP)，负责RNA的复制和转录。病毒的包膜来自宿主细胞的双层类脂膜，膜上镶嵌着3种膜蛋白，分别为HA、NA和M2 蛋白。HA在病毒与宿主细胞膜结合时与受体结合，是重要的中和抗原；NA在新复制的子代病毒释放上起重要作用，也是重要的抗原；M2蛋白具有离子通道活性，可调节膜内pH，它的作用能被一些抗病毒药所抑制，如金刚烷胺(Amantadine)和金刚乙胺(Rimantadine)，其中金刚烷胺是通过阻断M2的离子通道作用来抑制病毒复制，从而有助于阻止病情发展，减轻病情。M2基因包含14 39和7 995两个部分，其初始转录产物在剪切40 727位的内含子后，拼接成成熟的mRNA后翻译成M2蛋白。M2蛋白是97个氨基酸的完整膜蛋白， 大量表达于感染细胞表面，包括细胞外氨基端(23个氨基酸残基)、跨膜区(25 43氨基酸残基)以及位于细胞内的羧基端( 个氨基酸残基)。膜表面的M2蛋白是以四聚体形式存在的，首先两个M2蛋白单体通过N端17位和19位的Cys之间形成的二硫键形成二聚体，然后两个二聚体再通过非共价键作用而形成四聚体，它们的跨膜区形成一个跨膜螺旋， 作为离子通道。其中的37位His为质子结合位点，对离子通道的功能是至关重要的，而W41 则作为粒子通道的大门，对离子通道的功能同样重要。目前使用的禽流感疫苗主要是直接诱导针对病毒膜蛋白HA产生中和抗体。虽然这些疫苗的应用在对防控流感的过程中起到很好的作用，但是由于流感病毒HA和NA亚型众多，经常发生抗原转变和抗原漂移，使其抗原性表现出很大的变异。虽然近年来对流感病毒表面抗原HA和NA氨基酸序列甚至三维结构进行了测定，但流感病毒表面抗原的变异规律及其抗原决定簇出现的规律仍无法预测，因此每年都必需针对当年的流感病毒流行株来开发新疫苗，给流感疫苗的生产供应和免疫实施都带来很大困难。与HA、NA不同，流感病毒M2的氨基酸序列高度保守，从1933年首次分离到人A型流感病毒株A/WS/33 (HlNl)以来， 尽管经历了 4次世界性大流行，M2胞外区都未发现明显差异。对1918年西班牙的流感毒株测序结果也是如此。虽然流感患者中只有少部分能查到M2抗体，但M2的抗血清确实有抑制流感病毒复制的功能。因此，人们认为M2也是流感病毒的保护性抗原，有可能发展成为具有交叉保护能力的“通用流感疫苗”的候选抗原，可以解决上述HA、NA变异和疫苗更换毒株问题，因此，目前世界各国都正在进行M2相关疫苗的研制。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有禽流感疫苗缺少交叉保护的缺点，提供一种免疫效率高、通用性好的A型禽流感重组噬菌体疫苗。本专利技术的A型禽流感重组噬菌体疫苗，以重组噬T7菌体为抗原，所说的重组T7噬菌体表面表达有氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的H5亚型A禽流感病毒M2蛋白膜外区 23肽(Mk)，所说的H5亚型禽流感病毒是比对NCBI发表的H5亚型禽流感病毒基因序列后选取的优势流行毒株，所说的M2e基因由两拷贝的优势流行毒株的M2e基因插入T7噬菌体 PlOB基因下游表达获得。所述的两拷贝的11加基因选自以下序列的核苷酸1)具有SEQID NO 1所示核苷酸序列；2)具有SEQID NO :1所示序列经增加或减少拷贝数的核苷酸序列；3)具有SEQID NO :1所示序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍表达具有 GnRH主要抗原活性多肽的核苷酸序列。所说的疫苗中还包含用于乳化重组T7噬菌体的白油佐剂。本专利技术的A型禽流感重组噬菌体疫苗的构建方法，包括下列步骤A、构建重组噬菌体(1)合成一段DNA序列，该DNA序列克隆至pUC-19载体多克隆位点中，DNA序列的5， 端有酶切位点EcoR I，3，端含有酶切位点Hind III，其DNA序列如SEQ ID NO 3所示；(2)用限制性内切酶EcoRI、Hind III将上述DNA序列从pUC-19载体上切下后插入T7 噬菌体多克隆位点的EcoR I和Hind III之间，构建重组噬菌体；(3)用T7噬菌体包装蛋白组装重组噬菌体，包装产物通过琼脂糖夹心法扩增，用PCR 方法筛选阳性重组噬菌体，重组噬菌体展示两拷贝的M2e，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示；B、重组噬菌体的制备甘油冻存的E. coli BL21菌株在LB体培养基平面上划线接种，37°C过夜培养； 从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB培养液，37°C、200转/分震荡培养过夜，取3mL过夜培养物接种300mL LB培养液，培养至0D_=0. 8左右，挑取平皿上的单个噬菌斑，接种到培养好的BL21宿主菌中，37°C、100转/分震荡培养2-3小时，直至菌液由浑浊变为澄清，用 PEG沉淀的方法回收噬菌体，并按常规的方法测定噬菌体滴度，将回收的噬菌体调整浓度为 2 X 1013pfu/mL,并按照4%。的比例加入甲醛溶液，37°C、100转/分震荡灭活过夜；C、制备重组噬菌体油乳剂疫苗1)疫苗油相的制备4mL司本80，2mL司本85，94mL 10号矿物油，2g硬脂酸铝，充分混勻，121°C高压20分钟；疫苗水相的制备94mL滴度为2X 1013pfu/mL的灭活噬菌体，4mL高压灭菌吐温-80，3000转/分钟搅拌均勻；2)按照水相油相比1:3的比例在高速乳化器上乳化至稳定的油包水结构，即为制备的重组噬菌体油乳剂疫苗；所述的公猪去异味重组噬菌体疫苗的构建方法中，重组T7噬菌体的载体为T7 Select 415-lb。本专利技术具有如下技术效果(1)本专利技术利用噬菌体具有的病毒样颗粒的佐剂的特性，用T7噬菌体载体制备的重组噬菌体疫苗能够克服M2e自身免疫原性较弱的不足，有效的提高免疫原性，刺激机体产生更高水平的抗体。(》M2蛋白在禽流感病毒不同亚型之间具有保守型，该重组噬菌体疫苗有望成为 “通用型”禽流感疫苗的情景。(3)由于T7噬菌体易于培养、便于纯化，用于生产基因工程疫苗具有多种优势，本专利技术制备的A型禽流感重组噬菌体味疫苗便于大规模生产、成本低廉。附图说明图1为重组T7噬菌体的基因鉴定。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐海，王义伟，侯继波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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