具有较大张力的小环形核苷酸探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了具有较大张力的小环形核苷酸探针的制备及其应用，通过“无铜点击反应”制备得到了具有较大环张力的小环形核苷酸；其制备方法是将标记有相互作用性标记系统的核苷酸短单链和小环形核苷酸杂交，得到检测信号处于“TURN OFF”的探针，当目标分子诱导核苷酸短单链置换，信号被“TURN ON”，从而实现对目标分子的检测；本发明专利技术所制备的具有较大张力的小环形核苷酸探针，不仅能实现细胞外分子的高选择性识别，而且能有效地用于细胞内生物分子的识别与调控，并且制备过程温和，实验操作步骤简单，应用范围广，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子检测领域，具体涉及具有较大张力的小环形核苷酸探针，还涉及该探针的制备方法和应用。
技术介绍
MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因，其在动植物中参与转录后基因表达调控。miRNA可以通过与靶基因的完全互补或不完全互补来达到靶向切割mRNA或者抑制靶基因的翻译，从而起调节基因表达的作用；然而这些靶向mRNA广泛参与一些重要的细胞过程，包括细胞的生长、增殖、分化和凋亡，并且在不同的发育阶段其表达水平也有所不同。因此miRNA被当作许多细胞活力的重调控者。miRNA表达的改变与许多疾病和失调都有或多或少的关系，但是由于miRNAs高度的序列相似性、种类的多样性以及序列的短小性，miRNA临床诊断面临了一些挑战。采用传统的方法将miRNA从组织活细胞中分离出来，然后进行检测，这个过程中由于miRNA在细胞内的浓度是非常低的，所以必须经过富集和扩增，这会大大耗费时间、精力以及资金；NorthernBlot法被认为是miRNA检测和确认的金标准，但是其特异性和灵敏度均不高，虽然后来一些科学家也对该方法进行了拓展(比如采用锁核酸LNA修饰的杂交探针、核糖核酸酶保护法)，但总的来说这些方法相对来说需要的样品量较大、步骤繁琐、不适用于高通量分析等限制了其临床应用。采用RT-qPCR检测miRNA的灵敏度很高，样本量也相对少，但是由于miRNA序列短，要求引物的序列就更加短小，从而就要求更低的溶解温度，然而低的溶解温度会影响PCR扩增。导致所检测到的是前体的miRNA，而并非是成熟的miRNA，在细胞中前提的miRNA和成熟的miRNA的水平也不一致，所以该方法也常产生一些假阳性信号，且反应所需要酶和试剂以及检测的仪器都非常的昂贵，因此也使得成本相应较高。微阵列芯片技术(Microarray)发已被广泛用于miRNA的检测，相对于其他的检测方法其最大的优点是具有高通量性，然而该技术花费较大，需要机器加工，一些小型实验室也不具备这些条件；另外，其灵敏度也比较低。以纳米材料为基础的一些检测方法也越来越多的学者进行了研究，比如纳米金标记技术的检测、基于纳米孔的microRNA传感器、基于量子点的检测以及基于石墨烯的检测都为microRNA的检测提供的方法。分子信标(MB)，是发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，已被广泛用于检测DNA和RNA，具有很高的灵敏度和特异性，但是MB在活细胞中识别miRNA同源序列的应用仍然鲜有报道。近年来，几种新的miRNA检测方法已被报道，如安培磁力生物传感器、基于水凝胶的微流体方法以及等速电泳方法。虽然，电化学磁敏传感器等在检测miRNA有很高的特异性，但病毒蛋白的选择性识别是必要的。基于芯片上修饰水凝胶的方法和等速电泳法在检测miRNA中被证明是有效的，然而这些技术在检测活细胞中的miRNA的时候是非常复杂和耗时的。荧光原位杂交(FISH)被认为是活细胞中检测基因表达的最常用的方法，但是它的识别单碱基错配的miRNAs的能力是有限的。最近，四嗪介导的转移反应和滚环信号放大的方法已成功地应用于miRNA的检测和成像，然而，这些方法非常繁琐且不容易被广泛使用。因此，亟待需要一个更简单有效的、高度特异性的、敏感的miRNA的检测和成像的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供具有较大张力的小环形核苷酸探针；本专利技术的目的之二在于提供具有较大张力的小环形核苷酸探针的制备方法；本专利技术的目的之三在于提供具有较大张力的小环形核苷酸探针在细胞内生物分子的识别与活性调控方面的应；本专利技术的目的之四在于提供具有较大张力的小环形核苷酸探针在制备定性或定量检测核酸序列的试剂中的应用；本专利技术的目的之五在于提供含有所述具有较大张力的小环形核苷酸探针的试剂盒。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术通过设计具有较大张力的小环形核苷酸探针(简称为RP)，由闭合小环形核苷酸单链(简称为R)与核苷酸长度短于闭合小环形核苷酸单链的核苷酸短单链(简称为DNAQ)杂交形成；所述小环形核苷酸探针利用闭合小环形核苷酸单链特异识别目标检测物并与目标检测物杂交同时置换出核苷酸短单链；所述闭合小环形核苷酸单链探针与核苷酸短单链标记有相互作用性标记系统，该相互作用性标记系统在目标检测物与核苷酸短单链置换时产生一个或者多个可检测信号，结构如图1所示。由于闭合小环就有较大的环张力，增加的分子识别的难度，提高了识别的专一性；同时“半竞争性链置换”的使用，进一步提高了检测的选择性。此外，目标分子诱导的信号由“OFF”变为“ON”，降低了背景信号，提高了信噪比，并且拓展了其在细胞内的应用。本专利技术中，检测信号可以为如下方式标记的信号：化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、发光标记、化学发光标记或者金属标记，优选为荧光标记；分别于闭合小环形核苷酸单链标记报道分子或猝灭分子，核苷酸短单链标记相互作用的猝灭分子或报道分子。本专利技术的探针检测原理：由于R与DNAQ杂交，相互作用性标记系统以荧光标记为例，荧光报告基团与淬灭基团在荧光能量共转移作用(FRET)下荧光处于“关闭”状态，当目标检测物添加至反应体系中，目标检测物能够与DNAQ发生置换，然后与R杂交，此时荧光报告基团与淬灭基团之间的荧光能量共转移作用(FRET)被消除，荧光报告基团释放荧光从而荧光切换到“开启”状态。但是，如果目标检测物中有一个碱基发生错配时由于来自环形结的张力将不能完全置换出DNAQ链，从而能够区分完全互补序列与单碱基错配序列，并具有高的选择性。所以，本专利技术的RP可用核酸定性或定量检测，并用于区分完全互补核酸序列和单碱基错配核酸序列，其中核酸可以为DNA、RNA或miRNA。本专利技术中，闭合小环形核苷酸单链只要能形成环状即可，优选的，所述闭合小环形核苷酸单链的长度为22～60个碱基。本专利技术中，具有较大张力的小环形核苷酸探针的制备方法如下：将A信号标记的核苷酸、肽核酸、锁核酸单链的两端连接形成闭合环状或类似环状结构；然后将所形成闭合环状或类似环状结构与B信号标记的核苷酸长度短于闭合小环形核苷酸单链的核苷酸短单链杂交，得小环形核苷酸探针；所述A信号与B信号为相互作用性标记系统。其连接可以采用任意方式连接，优先的通过共价键、疏水相互作用、静电吸引、分子间引力或生物识别连接。本专利技术中，利用小环形核苷酸探针具有识别生物分子的能力，因此可本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有较大张力的小环形核苷酸探针，其特征在于：所述小环形核苷酸探针由闭合小环形核苷酸单链与核苷酸长度短于闭合小环形核苷酸单链的核苷酸短单链杂交形成；所述小环形核苷酸探针通过闭合小环形核苷酸单链识别目标检测物并杂交置换核苷酸短单链；所述闭合小环形核苷酸单链探针与核苷酸短单链标记有相互作用性标记系统，该相互作用性标记系统在目标检测物与核苷酸短单链置换时产生一个或者多个可检测信号。

【技术特征摘要】
1.具有较大张力的小环形核苷酸探针，其特征在于：所述小环形核苷酸探针由闭合小环形
核苷酸单链与核苷酸长度短于闭合小环形核苷酸单链的核苷酸短单链杂交形成；所述小环形
核苷酸探针通过闭合小环形核苷酸单链识别目标检测物并杂交置换核苷酸短单链；
所述闭合小环形核苷酸单链探针与核苷酸短单链标记有相互作用性标记系统，该相互作
用性标记系统在目标检测物与核苷酸短单链置换时产生一个或者多个可检测信号。
2.根据权利要求1所述具有较大张力的小环形核苷酸探针，其特征在于：所述闭合小环形核
苷酸的长度为22～60个碱基。
3.根据权利要求1所述具有较大张力的小环形核苷酸探针，其特征在于：所述可检测信号通
过如下方式标记：化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、发光标记、化学发光标记或
者金属标记。
4.权利要求1～3任一项所述具有较大张力的小环形核苷酸探针的制备方法，其特征在于：
具体步骤是将A信号标记的核苷酸、肽核酸、锁核酸单链的两端连接形成闭合环状或类似...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯旭利，唐亚琴，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50