一种同时检测沙丁胺醇和氟甲喹的免疫层析试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种同时检测沙丁胺醇和氟甲喹的免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背板，其特征在于，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，其中结合垫一半覆盖在硝酸纤维素膜上，样品垫部分覆盖于结合垫上，吸水垫部分覆盖于硝酸纤维素膜上；所述的硝酸纤维素膜上平行设置一条质控线和两条检测线。本发明专利技术还公开了这种试纸条的制备方法。本发明专利技术具有以下突出的优点：本发明专利技术的检测沙丁胺醇和氟甲喹的多残留免疫层析试纸条是利用抗原抗体的特异性反应实现的，因此特异性高，灵敏度好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种快速检测动物源性食品中沙丁胺醇和氟甲喹残留的方法，特别是两种标记物在同一试纸条上同时检测沙丁胺醇和氟甲喹的多残留免疫层析试纸条及其制备方法。
技术介绍
近年来，随着国家对克伦特罗残留打击力度的加大，一些不法商贩开始寻求新的替代品。沙丁胺醇具有相似的增加胴体瘦肉率的作用，且在体内代谢时间短，毒副作用相对较弱，并且检测手段相对滞后，因此成为克伦特罗的首选替代品。氟甲喹，一种广谱、能有效抵抗病菌的药物，用于治疗动物疾病，然而，氟甲喹对人具有一定的毒性作用，而且经动物毒理学实验证实有致畸作用，如果残留于食物中被人体摄入将危害人体健康，已被禁止使用，但不法商贩仍在使用。动物源性食品的兽药残留问题成为全世界关注的重点，对于兽药残留检测技术提出了新的要求。免疫层析分析方法具有高灵敏度、高特异性、操作简便、检测时间短、成本低等优点，适用于大量样品的快速现场检测，近年来在兽药残留检测领域得到了快速的发展。胶体金免疫层析技术(GoldImmunochromatographyAssay，GICA)是二十世纪八、九十年代在酶联免疫分析方法的基础上发展的新型快速免疫检测技术。该技术具有操作简单快速、结果容易判定、安全无污染等诸多优点。胶体碳作为标记物具有良好的稳定性、价格低廉、易于制备、黑色信号与白色背景层析膜强烈对比而显示出的高灵敏性以及还可定量分析等优点，具有广泛的应用前景。但之前使用的免疫层析试纸条多是检测一种物质，同时检测两种物质的较少，即使有也存在检测灵敏度低，检测不准确等问题。而同时检测沙丁胺醇和氟甲喹两种物质的的更是没有，这增加了动物性食品检测的困难和检测时间。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术创造旨在提出一种两种标记物在同一试纸条上同时检测沙丁胺醇和氟甲喹的多残留免疫层析试纸条方法。为达到上述目的，本专利技术创造的技术方案是这样实现的：一种同时检测沙丁胺醇和氟甲喹的免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背板，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，其中结合垫一半覆盖在硝酸纤维素膜上，样品垫部分覆盖于结合垫上，吸水垫部分覆盖于硝酸纤维素膜上；所述的硝酸纤维素膜上平行设置一条质控线和两条检测线。优选的，所述的结合垫上包被有抗体-胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有羊抗兔二抗构成的质控线，沙丁胺醇抗原构成的检测线a和氟甲喹抗原构成的检测线b。所述同时检测沙丁胺醇和氟甲喹的免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：(1)沙丁胺醇抗血清和氟甲喹抗血清纯化，得到沙丁胺醇多克隆抗体和氟甲喹多克隆抗体；(2)分别采用碳二亚胺法和混合酸酐法制备沙丁胺醇抗原和氟甲喹抗原；(3)采用柠檬酸三钠还原法制备20nm左右胶体金和用硼酸盐缓冲溶液配制胶体碳；(4)将步骤(1)纯化的沙丁胺醇多克隆抗体20μg和氟甲喹多克隆60μg分别加入到步骤(3)制备的1mL胶体金和300μL胶体碳中，制备抗体-胶体金标记物和抗体-胶体碳标记物；(5)将步骤(4)制备的抗体-胶体金标记物稀释5倍，包被于结合垫上；(6)将步骤(2)制备的沙丁胺醇抗原和氟甲喹抗原分别稀释8倍和5倍包被在硝酸纤维素膜上构成检测线a和检测线b，并将羊抗兔二抗稀释120倍包被于硝酸纤维素膜上构成质控线；(7)在PVC背板上按顺序依次粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，得到所述的检测沙丁胺醇和氟甲喹的试纸条；(8)将沙丁胺醇和氟甲喹混合配制成一系列梯度的标品溶液，取稀释后的胶体碳标记的抗体与混合标品溶液，混合均匀后滴加到加样孔中，10min后观察结果。本专利技术纯化了沙丁胺醇抗血清和氟甲喹抗血清，得到了沙丁胺醇多克隆抗体和氟甲喹多克隆抗体，备用。制备沙丁胺醇抗原和氟甲喹抗原作为检测线的包被抗原，采用购买的羊抗兔二抗作为质控线的捕获抗体。利用竞争法来检测沙丁胺醇和氟甲喹，根据检测线条带的深浅判断待测样品中是否含有沙丁胺醇和氟甲喹。若质控线条带无颜色，则该试纸条失效。与现有国内外检测方法相比，本专利技术具有以下突出的优点：1、本专利技术的检测沙丁胺醇和氟甲喹的多残留免疫层析试纸条是利用抗原抗体的特异性反应实现的，因此特异性高，灵敏度好。2、本专利技术的检测试纸条检测时间快速(10分钟)且不需要任何特殊仪器、设备，检测成本低。3、本专利技术的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。4、检测时胶体金标记沙丁胺醇抗体，在试纸条表现为红色条带，代表沙丁胺醇的检测，胶体碳标记氟甲喹抗体，在试纸条表现为黑色条带，显示的是氟甲喹的检测，红色条带和黑色条带对比明显，使检测结果更加直观。附图说明图1本专利技术试纸条结构示意图1样品垫、2结合垫、3硝酸纤维素膜、4吸水垫5检测线a、6检测线b、7质控线、8PVC板。具体实施方式实施例一一种同时检测沙丁胺醇和氟甲喹的试纸条的制备方法1、标记物的制备胶体金的制备：采用柠檬酸三钠法制备胶体金。先取200mL去离子水倒入用于制备胶体金的三角瓶中，于恒温电磁搅拌器上加热至沸腾一分钟进一步清洗之后，小心倒掉沸水。取浓度为0.01％HAuCl4(四氯金酸)水溶液(已过0.22μm水系膜)100mL倒入三角瓶，加热到沸腾。沸腾后，快速小心加入2.25mL1％的柠檬酸三钠水溶液(已过0.22μm水系膜)，2分钟内可观察到明显的颜色变化。当胶体金溶液呈现稳定的颜色不再变化时继续煮沸15分钟。室温冷却后用去离子水定容至100mL，转移至清洗过的玻璃瓶中4℃保存备用。制备好的胶体金溶液清亮透明，呈酒红色，表面无漂浮物。胶体碳的制备：将炭黑分散到硼酸盐缓冲溶液中，超声20min，得到分散均匀的胶体溶液，且其浓度为0.5mg/mL。2、抗体-标记物结合物的制备沙丁胺醇抗体—胶体金标记物的制备：按每mL胶体金加入20μL0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值，然后按每mL胶体金加入20μg沙丁胺醇抗体，轻微振摇使其混匀，4℃静置60分钟。然后按每mL胶体金中加入20μL20％的BSA以封闭胶体金表面多余的残基。室温静置30分钟后，再向其中加入10μL20％的PEG20000(聚乙二醇20000)后室温静置30分钟。4℃条件下2000rpm低速离心15分钟弃沉淀取上清。将上清于4℃条件下10000rpm高速离心30分钟。弃去上清液，向得到的沉淀中加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测沙丁胺醇和氟甲喹的免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背板，其特征在于，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，其中结合垫一半覆盖在硝酸纤维素膜上，样品垫部分覆盖于结合垫上，吸水垫部分覆盖于硝酸纤维素膜上；所述的硝酸纤维素膜上平行设置一条质控线和两条检测线。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测沙丁胺醇和氟甲喹的免疫层析试纸条，包括样品垫、结合
垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背板，其特征在于，在PVC背板上按顺
序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，其中结合垫一半覆
盖在硝酸纤维素膜上，样品垫部分覆盖于结合垫上，吸水垫部分覆盖于硝酸
纤维素膜上；所述的硝酸纤维素膜上平行设置一条质控线和两条检测线。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测沙丁胺醇和氟甲喹的免疫层析试纸
条，其特征在于，所述的结合垫上包被有抗体-胶体金标记物；所述的硝酸
纤维素膜上分别包被有羊抗兔二抗构成的质控线，沙丁胺醇抗原构成的检测
线a和氟甲喹抗原构成的检测线b。
3.权利要求2所述一种同时检测沙丁胺醇和氟甲喹的免疫层析试纸条的制
备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)沙丁胺醇抗血清和氟甲喹抗血清纯化，得到沙丁胺醇多克隆抗体和
氟甲喹多克隆抗体；
(2)分别采用碳二亚胺法和混合酸酐法制备沙丁胺醇抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘冰，童贝，生威，张燕，王硕，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12