本发明专利技术公开了一种免疫亲和吸附剂，该吸附剂是由固相载体和与其偶联的喹诺酮类药物单克隆抗体组成；所述喹诺酮类药物单克隆抗体是由单克隆杂交瘤细胞株Ａ－４－３ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０６６分泌的。本发明专利技术还公开了由所述免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱，其至少能够净化１３种喹诺酮类药物，包括环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹。本发明专利技术的提纯方法结合色谱法高效检测喹诺酮类药物的含量，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学领域，具体的说是一种用于净化喹诺酮类药物的免疫亲和色谱柱。背景资料随着生命科学的发展，人们对生物体内的物质及其变化产生了越来越浓厚的兴趣，而生物样本的分析就成为探索和发现生命奥秘的必要手段。由于生物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。免疫亲和色谱(Immunoaffinity Chromatography，IAC)是一种将免疫反应与色谱分析方法相结合的分析方法。它的高度选择性和高亲和性无疑使分析过程简化。在兽药残留分析中，IAC最简单而且最有效的应用方式是作为理化测定技术(如HPLC，GC)的样品净化手段，这种联用方法可使免疫学技术和理化技术在选择性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，并避免了免疫分析法(如ELISA，RIA)直接测定样品的诸多不足。目前，该方法在抗体、激素、多肽、酶、重组蛋白、受体病毒及小分子化合物的分析中被广泛应用。喹诺酮类药物是近20多年来发展十分迅速的一类抗菌药，因其抗菌谱广、抗菌活性强、半衰期长、高效低毒、使用方便、剂型较多等优点，在国内外人医及兽医临床上普遍用于防治细菌感染性疾病。在我国人医上的应用呈逐年上升的趋势，解放军总医院1995～1999年的抗菌药使用调查资料统计表明，各类抗菌药(含处方药)应用金额构成比例中，QNs药物一直居第2～3位，仅次于头孢菌素和青霉素等β-内酰胺类抗生素；QNs在我国畜禽水产养殖中的应用也是如此，与磺胺类、青霉素类药物共同成为兽医临床上应用的三大类抗菌药。随着喹诺酮类抗菌药在兽医临床和水产养殖中的应用，其残留问题已引起广泛的关注。QNs残留除了其毒副作用(如对中枢神经系统的影响、药物间的相互作用、光敏性等)对人直接危害外，更为严重的是动物性食品中残留较低浓度的药物容易诱导人类致病菌产生耐药性，从而不利于该类药物在人类疾病的治疗，目前流行病学调查研究发现其耐药菌株正逐年上升，新开发的喹诺酮类药品的市场周期大大缩短。因此，喹诺酮类药物在动物性食品中的残留问题受到极大关注。我国农业部、欧盟、美国等都制定了该类药物在各种动物性食品中的最高残留限量(Maximum residue limit，MRL)。目前检测喹诺酮类药物(环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹)的方法主要有高效液相色谱法-荧光(HPLC-FLD)、液-质联机(LC-MS-MS)和酶联免疫法(ELISA)等。这些方法的前处理利用液-液分配，常规的SPE柱净化和分离，都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时间长等缺点。免疫亲和技术是上世纪90年代在分析领域得到应用的新技术，但利用免疫亲和柱同时净化生物基质中的环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹等喹诺酮类药物未见报道，更无商品化的IAC柱出售。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种净化喹诺酮类药物的免疫亲和色谱柱。本专利技术的免疫亲和色谱柱是由免疫亲和吸附剂为填料装柱而成的；所述免疫亲和吸附剂是由固相载体和与其偶联的喹诺酮类药物单克隆抗体组成；所述喹诺酮类药物单克隆抗体是以喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的。将诺氟沙星C-7位的哌叮环上的亚氨基用丁二酰氯酰化后再水解得到喹诺酮类药物半抗原，再与载体蛋白偶联得到具有免疫源性的抗原。本专利技术将喹诺酮类药物用琥珀酸酐酰化，再与载体蛋白偶联得到免疫原。半抗原与载体蛋白的结合比例过低或过高都对免疫不利，半抗原与卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的结合摩尔比分别为31.6∶1和23∶1。所述固相载体可为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶等，优选为Sepharose 4B。所述喹诺酮类药物单克隆抗体优选为对环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-4-3CGMCC No.2066。所述对环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-4-3CGMCCNo.2066已于2007年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。所述载体蛋白可为牛血清白蛋白或卵清蛋白等常用载体蛋白。所述免疫亲和吸附剂可装载入柱中制成免疫亲和色谱柱，该免疫亲和色谱柱也属于本专利技术的保护范围。含有上述免疫亲和吸附剂或免疫亲和色谱柱的试剂盒也属于本专利技术的保护范围。所述试剂盒中还包括洗脱液，所述洗脱液为甲醇/2％氨水(7∶3，v/v)。所述试剂盒中还包括洗涤液和保存液；所述保存液可为0.01M，pH 7.4的磷酸盐缓冲液，所述0.01M，pH 7.4的磷酸盐缓冲液可为1L中含有0.27g KH2PO4，0.29g KCl，2.9g Na2HPO4·12H2O，8.8g NaCl，0.02g NaN3的溶液；所述洗涤液可为0.01M，pH 7.4的磷酸盐缓冲液，所述0.01M，pH 7.4磷酸盐缓冲液可为1L中含有0.27g KH2PO4，0.29gKCL，2.9g Na2HPO4·12H2O，8.8g NaCL的溶液。该免疫亲和吸附剂以及含有该免疫亲和吸附剂的色谱柱基于免疫反应和色谱反应，适合从生物样品(肌肉、肝、肺、肾、血浆等)中净化13种喹诺酮类药物，便于残留分析。在该免疫亲和吸附剂中，喹诺酮类药物鼠单克隆抗体与溴化氰活化的Sepharose 4B的偶联率为98.5％，偶联有喹诺酮类药物鼠单克隆抗体的免疫亲和色谱柱对环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹的动态柱容量分别为1976、2135、2035、1933、1987、1589、1738、1448、1793、1645、1498、1425、1632 ng/mL，绝对柱容量分别为395、427、407、396、397、319、347、289、358、329、299、285、326 ng/mg，在使用了15次后柱容量为总柱容量的39％左右，保存期为1年。本专利技术所提供的提纯13种喹诺酮类药物的方法，包括以下步骤1)样品的前处理取动物组织匀浆物按2.00±0.02g的量加入10mL磷酸盐缓冲液溶液，涡动混匀，3500rpm离心5分钟，样品再重复提取一次，合并上清液即为样品溶液；2)取上述提取的样品溶液，过上述免疫亲和色谱柱，然后先后用20mL洗涤液、30mL超纯水洗涤，然后用4mL洗脱液洗脱，收集洗脱液，得到纯化的喹诺酮类药物。本专利技术的免疫亲和色谱柱具有高选择性，使样品前处理过程大大简化，尤其适用于肌肉、肝和血浆中微量喹诺酮类药物类药物的前处理，分析质量得到改善。免疫亲和吸附剂的高选择性使得喹诺酮类药物分析方法的检测限将主要取决于取样量，这是单纯理化手段难以达到的；本专利技术的免疫亲和色谱柱对本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种净化喹诺酮类药物的免疫亲和吸附剂，其特征在于，是由固相载体和与其偶联的喹诺酮类药物单克隆抗体组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈建忠，丁双阳，何方洋，赵思俊，江海洋，冯才伟，张素霞，万宇平，史为民，孙倩，
申请(专利权)人：北京望尔生物技术有限公司，北京望尔康泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。