本发明专利技术公开了富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂及其制备方法与应用。该富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂，是将赭曲霉毒素A多克隆抗体和含氨基的固相载体偶联得到的偶联物；所述赭曲霉毒素A多克隆抗体按照包括如下步骤的方法制备：以赭曲霉毒素A-NHS活性酯与载体蛋白的偶联物为免疫原免疫非人哺乳动物得到抗血清，从所述抗血清中纯化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗体。本发明专利技术富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂及其亲和色谱柱具有浓缩待测样品中赭曲霉毒素A浓度，提高检测下限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品过柱时间达到快速检测的作用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂及其制备方法与应用。该富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂，是将赭曲霉毒素A多克隆抗体和含氨基的固相载体偶联得到的偶联物；所述赭曲霉毒素A多克隆抗体按照包括如下步骤的方法制备：以赭曲霉毒素A-NHS活性酯与载体蛋白的偶联物为免疫原免疫非人哺乳动物得到抗血清，从所述抗血清中纯化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗体。本专利技术富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂及其亲和色谱柱具有浓缩待测样品中赭曲霉毒素A浓度，提高检测下限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品过柱时间达到快速检测的作用。【专利说明】富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂及其制备方法与应用
本专利技术涉及富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂及其制备方法与应用。
技术介绍
赭曲霉毒素是赭曲霉及青霉菌中某些产毒菌株侵染粮食、食品、饲料及其他农副产品后所产生的有毒代谢产物。赭曲霉毒素A是赭曲霉毒素中毒性最强、产量最高的一种，对人和动物有强烈的毒害作用，可以导致动物的肾萎缩、胎儿畸形、流产、死亡，并且具有高度的致癌性。赭曲霉毒素A在大麦、小麦、燕麦、玉米等大多数谷物中存在。用受赭曲霉毒素A污染的谷物饲养的家禽也会受到污染，赭曲霉毒素A直接或间接危及人体健康。因此，赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一个引起世界关注的毒素。1993年，国际癌症研究院(TheInternational Agency for Researchon Cancer)将赫曲霉毒素定为213组致癌物质(可能是人类致癌物)。各国纷纷制定了谷物中赭曲霉毒素A的限量标准，第56次FA0/WH0食品添加剂联合专家委员会会议对赭曲霉毒素A进行了危险性评价并制定了谷物食品中赭曲霉毒素A最大残留量标准为5 u g/kg，我国和欧盟及其成员国也规定在谷物中最大残留量为 5 ii g/kg。目前赭曲霉毒素A的测定方法有多种，如:薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱法(LC/MS)、免疫学检测等方法。由于生物样本成分复杂，待测物浓度低，大多数取样量少。这就对分析方法的灵敏度、准确度有更高的要求。免疫亲和层析技术是一种集免疫反应和层析技术相结合的分析方法，在提纯物质上是一项效率高、纯度高、快速的技术，可以使免疫检测技术(如ELISA等)和层析技术在特异性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，避免了免疫分析法直接测定样品的不足。使用免疫亲和色谱纯化富集样品中的赭曲霉毒素A，可以很大程度的提高分析结果的准确性、可靠性和分析的极限。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题克服现有技术的不足，提供一种高柱容量(高富集率)的赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂及其制备方法。本专利技术所提供的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂，是将赭曲霉毒素A多克隆抗体和含氨基的固相载体偶联得到的偶联物(吸附剂)；所述赭曲霉毒素A多克隆抗体可按照包括如下步骤的方法制备:以赭曲霉毒素A-NHS活性酯与载体蛋白的偶联物为免疫原免疫非人哺乳动物得到抗血清，从所述抗血清中纯化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗体。其中，所述非人哺乳动物可为兔、羊、鼠、豚鼠或马等。上述富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂中，所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯是赭曲霉毒素A通过N，N-二环己基碳化二亚胺(N，N’ -dieyelohexylcarbodiimide, DCC)与N-羟基琥拍酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS)反应生成的活性酯。上述富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂中，所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯可按照包括如下步骤的方法制备:I)将碘乙酸通过 N，N- 二环己基碳化二亚胺(N，N，-di eye lohexy lcarbodiimide,DCC)与N-轻基琥拍酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS)反应生成活性酯,所述活性酯为NHS-碘乙酰活性酯；2)将所述NHS-碘乙酰活性酯与赭曲霉毒素A进行取代反应，得到赭曲霉毒素A-NHS活性酯。上述富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂中，所述I)可为将碘乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-二环己基碳化二亚胺在黑暗中进行缩合反应，得到NHS-碘乙酰活性酯。进一步，所述I)可为将碘乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-二环己基碳化二亚胺以269:695:582的摩尔比，在四氢呋喃中，20°C _25°C在黑暗中进行缩合反应，反应完毕后，以IOOOOg离心，取上清液得到NHS-碘乙酰活性酯；所述2)可为将赭曲霉毒素A的四氢呋喃溶液与所述上清液(所述NHS-碘乙酰活性酯)混匀，在20-25°C进行取代反应，得到所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯。上述富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂中，从所述抗血清中纯化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗体的方法包括:将所述赭曲霉毒素A-NHS活性酯与所述含氨基的固相载体偶联得到的偶联物作为纯化所述赭曲霉毒素A多克隆抗体的亲和层析介质，从所述抗血清中通过亲和层析纯化得到所述赭曲霉毒素A多克隆抗体；和/或所述亲和层析中用体积百分浓度为3%的乙酸水溶液洗脱所述赭曲霉毒素A多克隆抗。上述富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂中，所述含氨基的固相载体可为含氨基的琼脂糖凝胶或为含氨基的葡聚糖凝胶；和/或，所述载体蛋白为血兰蛋白或牛血清白蛋白。制备上述富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂的方法也属于本专利技术的保护范围。以上述免疫亲和吸附剂为填料的富集赭曲霉毒素A的免疫亲和色谱柱、含有上述免疫亲和吸附剂或上述免疫亲和色谱柱的富集赭曲霉毒素A的试剂盒也属于本专利技术的保护范围。所述试剂盒还包括上样缓冲液、漂洗液及洗脱液。所述的上样缓冲液可为PBS，所述漂洗液可为PBSt，所述的洗脱液可为乙酸和甲醇水溶液，所述乙酸和甲醇水溶液的溶剂为水，溶质为乙酸和甲醇，乙酸的体积百分浓度为3%，甲醇的体积百分浓度为80%。每升所述PBS 由 NaCl 8.0g, KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4.12H20 2.9g，加蒸水定容至lOOOmL，调pH值到7.4制成。每升所述PBSt 由 NaCl 8.0g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H20 2.9g,吐温-20 500uL，加蒸水定容至IOOOmL, il pH值到7.4制成。上述免疫亲和吸附剂、上述免疫亲和色谱柱、或上述试剂盒在富集赭曲霉毒素A中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述富集赭曲霉毒素A具体可为富集谷物或饲料中的赭曲霉毒素A。上述应用中，包括如下得到用于上柱的样品溶液的步骤:将谷物或饲料研碎并通过Imm的试验筛，不要研成粉末。称取5g (精确到0.0lg)研碎的样品于15mL离心管中，加入Ig氯化钠和IOmL提取液(80%甲醇水溶液)，拧好盖子，高速震荡，萃取5min ;然后4000rpm离心5min，准确移取4mL上清液于50mL的离心管中，加 PBS (每升 PBS 由 NaCl 8.0g, KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4.12H202.9g，加蒸水定容至lOOOmL，调pH值到7.4制成)稀释至刻度，混合均匀，经玻璃纤维滤纸过滤，得到用于上柱的样品溶液。上述应用中，还包括将上述用于上柱的本文档来自技高网...
【技术保护点】
制备富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂的方法，包括将赭曲霉毒素A多克隆抗体和含氨基的固相载体偶联得到富集赭曲霉毒素A的免疫亲和吸附剂的步骤；所述赭曲霉毒素A多克隆抗体按照包括如下步骤的方法制备：以赭曲霉毒素A?NHS活性酯与载体蛋白的偶联物为免疫原免疫非人哺乳动物得到抗血清，从所述抗血清中纯化得到所述富集赭曲霉毒素A多克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周晓，李川山，谢军，李炜，韦素梅，刘运龙，谢体三，萧浩，徐德林，林丰，林丹超，
申请(专利权)人：广西壮族自治区粮油科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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