本发明专利技术提供一种肿瘤患者血清中活性糖蛋白组合物的分离方法及应用，属于医学生化技术领域，该分离方法的步骤为：采集肿瘤患者血清，分离血清，进行过滤除菌，加入硫酸铵溶液，去除蛋白沉淀，透析除盐，直到铵离子完全消除，最终获得活性糖蛋白组合物。本发明专利技术的技术方案能够有效地从肿瘤患者血清中分离出活性糖蛋白组合物，其方法工序简单，条件易控，对设备的要求较低，成本低廉，损耗小，而且得出的组合物可高效诱导DC-CIK细胞体外杀伤人肿瘤细胞。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学生化
，具体地说是一种从肿瘤患者血清中分离出活性糖蛋白组合物的技术，以及该组合物可高效诱导DC-CIK细胞体外杀伤人肿瘤细胞的应用。
技术介绍
—般的，人体中的蛋白质中有一多半发生了糖基化修饰。糖蛋白作为细胞信息功能的承担者，既是激素、凝集素、酶、毒素、病菌等的识别点，又是细胞表面抗原、糖分化抗原和癌发育抗原。研究发现，癌细胞比健康细胞糖蛋白的水平更高，直接促进恶性肿瘤发生，因此肿瘤患者血清中含有较多种类的糖蛋白抗原。临床上，常通过检测特定类型的糖蛋白用于肿瘤的诊断。然而，提取血清糖蛋白用于肿瘤治疗的研究鲜有报道。首先是因为血清糖蛋白量少，再次肿瘤异质性高，提取患者血清糖蛋白难以形成产品。随着肿瘤免疫治疗技术的进步，负载肿瘤抗原的DC免疫治疗技术以及相关的DC-CIK、DC-CTL技术作为个性化治疗技术被临床应用。DC-CIK生物免疫疗法(或DC+CIK)是指与DC细胞共培养的CIK细胞。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-1nduced killers, CIK)是一类抗肿瘤抗病毒效应细胞，能在体外被诱导并大量增殖。树突状细胞(dendritic cell, DC)是有效的专职抗原提呈细胞，成熟的DC可以通过II型组织相容性抗原(MHC-1I )等途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制。CIK细胞和DC细胞是细胞免疫治疗的2个重要组成部分，两者联合可确保高效的免疫反应。目前DC体外致敏所使用的抗原主要是已知的肿瘤特异性抗原和肿瘤细胞全溶物。由于大多数肿瘤细胞具有异质性，而且经体外培养后容易突变进而抵抗单一抗原的免疫攻击，因此致敏DC后所获得的DC-CIK临床效果不佳。患者自体肿瘤细胞全溶物只能用于手术前留取的患者，临床实际中进行DC疗法的患者大多为手术后的患者，难以获得新鲜肿瘤细胞，这些都大大限制了 DC个性化疗法的临床效果。目前常用的血清糖蛋白浓缩技术是凝集素提取法，但成本高、损耗大，不利于免疫治疗的临床推广。
技术实现思路
本专利技术的技术任务是解决现有技术的不足，提供。本专利技术的技术方案是按以下方式实现的，本专利技术的一种肿瘤患者血清中活性糖蛋白组合物的分离方法的步骤为: (1)采集肿瘤患者血清，分离血清，用0.22 μπι的滤膜对得到的血清进行过滤除菌， (2)取上述步骤所得除菌后的血清，加入生理盐水，于25°C环境下，加入250C100%饱和溶解度的硫酸铵溶液，使得含有血清的硫酸铵溶液中硫酸铵的最终饱和溶解度至50%的饱和溶解度，静置30min， (3)12000rpm离心15min，去除蛋白沉淀， (4)取步骤(3)上清，将25°C硫酸铵50%饱和溶解度溶液制备成90%饱和溶解度溶液所加入的干硫酸铵的量，加入到上清液中制成90%饱和溶解度硫酸铵溶液，静置30min， (5)12000rpm离心15min，去除蛋白沉淀， (6)收集步骤(5)上清，透析除盐，直到铵离子完全消除，最终获得活性糖蛋白组合物。分离方法所获得的活性糖蛋白组合物，其分子量在33KD?37KD之间，含糖量为35% ?45%ο利用上述一种肿瘤患者血清中活性糖蛋白组合物的分离方法制备的活性糖蛋白组合物在制备致敏抗原中的应用。本专利技术与现有技术相比所产生的有益效果是: 本专利技术的技术方案能够有效地从肿瘤患者血清中分离出活性糖蛋白组合物，其方法工序简单，条件易控，对设备的要求较低，成本低廉，损耗小，而且得出的组合物可高效诱导DC-CIK细胞体外杀伤人肿瘤细胞。【附图说明】附图1是本专利技术的实验数据柱状对比图。【具体实施方式】下面对本专利技术的作以下详细说明。实验I: 肿瘤患者血清中活性糖蛋白组合物的分离制备试验一、材料与试剂 1、仪器:三角烧瓶、试管、玻璃棒、烧杯、磁力搅拌器、滤器。2、试剂:(NH4) 2S04、BaCl2、NaOH、Hgl2、ΚΙ、ΝΗ40Η。3、纳氏液制备:称取5.75g的HgI2和4g的KI置于25ml蒸馈水中，再加入25ml的6mol/L NaOH溶液，即得双碘化物溶液，将其存于棕色的瓶中备用。将70ml的10重量％的Na0H、15ml双碘化物溶液和15ml蒸馏水混合得到纳氏试剂。二、具体步骤为: 1、经临床判断适合采血肝癌肿瘤患者采血50ml，在3，600rpmX20min条件下离心，分离血清，56 °C水浴30min，再用0.22 μπι的滤膜对得到的血清进行过滤除菌。2、取1ml血清，加生理盐水10ml，在室温24°C下，逐渐加入100%饱和的硫酸铵溶液20ml，使得终浓度50%饱和度，静置30min。3、12000rpm离心15min，去除蛋白沉淀。4、取上清，在室温24°C下，按室温24°C下照硫酸铵50%饱和度制备成90%饱和度所加入的干硫酸铵的量26.5g，逐渐加入，边加边搅拌，充分混合后，获得大约90%饱和度硫酸铵溶液，静置30min。5、过滤去除沉淀，12000rpm离心15min，去除蛋白沉淀。6、收集上清，透析除盐，直到铵离子完全消除。以1°泌&(:12检查透析液中的SO42或以纳氏试剂检查NH 4+ (取3?4ml透析液，加试剂I?2滴，出现砖红色即认为有NH4+存在)，直至无SO42或NH 4+出现为止。7、透析上清液即为一种活性糖蛋白组合物。含糖量的测定采用相关文献记载的蒽酮-硫酸法测定。其中本专利技术提取的血清糖蛋白组合物中糖的重量百分比在35% — 45%。糖蛋白的分子量采用SDS-PAGE电泳的方法测定，本专利技术提取的血清糖蛋白组合物分子量在33-37KD之间。为优选不同饱和度硫酸铵溶液分离得到的血清糖蛋白组份对DC-CIK诱导活性，我们在上步骤4中分别选取按照从50%饱和度制备成70%、90%、100%的饱和度硫酸铵溶液做加入的干硫酸铵的量，加入到上清液，所获得硫酸铵溶液，在此溶液下获得的血清可溶组份，作为测试试剂a、b、C、d。实验2: 杀瘤活性对比试验 来自肝癌患者血清糖蛋白组合物诱导DC-CIK对人肝癌细胞株IfepG2体外杀瘤活性的影响 从上述采集的肝癌患者外周血中分离PBMC，加生理盐水离心洗涤3次。弃上清，将沉淀细胞贴壁培养，2h后取出培养的细胞，悬浮的淋巴细胞转移至培养瓶中，加入IFN-γ，第二天加入CIK诱导培养基，诱导培养CIK ;含有贴壁细胞的瓶中各加入40mL的免疫细胞无血清培养液和rhIL4和rhGM-CSF因子，诱导培养DC。DC于第7天加入Iml本专利技术制备的组合物和TNF，第8天铲下收集后与相应的CIK混合共培养。共培养的DC-CIK 10天后，将培养瓶中的细胞悬液用离心管收集，终浓度1%，加入细胞沉淀，配成细胞悬液。以人肝癌细胞株!fepG2为靶细胞，采集肝癌患者血清浓缩物制备特异性DC-CIK细胞，设置效靶比30:1混合细胞，检测24小时平均杀伤活性。普通DC-CIK在上述的实验步骤中没有加入本专利技术的组合物，分离前诱导的DC-CIK在上述的实验步骤中直接加入患者血清，与这两种方式相比，利用本专利技术的组合物诱导的DC-CIK体外杀瘤活性达到了 83%，明显高于前两者(见图1)。实验3: 将实施I中获得试剂a、b、c、d分别重复实验2，得出各个试剂在诱导的DC-CIK体本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肿瘤患者血清中活性糖蛋白组合物的分离方法，其特征在于：该分离方法的步骤为：（1）采集肿瘤患者血清，分离血清，用0.22μm 的滤膜对得到的血清进行过滤除菌，（2）取上述步骤所得除菌后的血清，加入生理盐水，于25℃环境下，加入25℃ 100%饱和溶解度的硫酸铵溶液，使得含有血清的硫酸铵溶液中硫酸铵的最终饱和溶解度至50%的饱和溶解度，静置30min，（3）12000rpm离心15min，去除蛋白沉淀，（4）取步骤（3）上清，将25℃硫酸铵50%饱和溶解度溶液制备成90%饱和溶解度溶液所加入的干硫酸铵的量，加入到上清液中制成90%饱和溶解度硫酸铵溶液，静置30min，（5）12000rpm离心15min，去除蛋白沉淀，（6）收集步骤（5）上清，透析除盐，直到铵离子完全消除，最终获得活性糖蛋白组合物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨继建，杜丽英，田丽娜，王伟，秦倍倍，徐娅妮，
申请(专利权)人：山东景源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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