海水芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）SWJS44及其液体发酵产蛋白酶的应用。该菌于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7389。经单因素实验优化了海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）SWJS44产蛋白酶的条件，其培养、发酵条件简单，遗传性质稳定。

【技术实现步骤摘要】
海水芽孢杆菌及其应用
本专利技术涉及深海中微生物筛选及发酵领域，具体涉及海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）SWJS44及其液体发酵产蛋白酶的方法。
技术介绍
蛋白酶（Protease）属于水解酶类，是最重要的三大工业用酶之一，销售额约占全球酶制剂市场的60%。蛋白酶在食品、酿造、医药、纺织、皮革、日用化学、洗涤剂、饲料以及水产加工等多个行业有广泛应用，对国民经济的发展起着重要的作用。随着发酵技术的进步及基因工程的崛起和广泛应用，利用微生物产酶成为了商品酶制剂生产的主要方法。首先，微生物生长繁殖速度快，产酶量较高；其次，微生物无处不在，几乎在所有的环境中都有微生物存在，由于环境的不同，微生物的种类以及所产酶也不尽相同，从而不同类型以及特性的酶制剂几乎都能从微生物中获得，如高温酶、中温酶、低温酶、耐高盐酶、耐碱酶等；再次，微生物培养条件容易控制，可进行连续的发酵，并且可以大批量生产，不仅能降低生产成本，而且能保证酶制剂的供应量。海洋中低温、高盐、高压环境使得海洋中的微生物及其所产的胞外酶具有陆生微生物所不具备的特性。海洋微生物所产酶具有作用pH范围宽，最适pH和反应温度适中，温度对蛋白酶活力影响小等特点。然而，目前已鉴定出的海洋微生物还不到总量的5%，已发现的活性物质只占总数的1%。从深海海泥中筛选出产特异性蛋白酶的微生物菌株，并研究了其蛋白酶酶学特性，以期为深海微生物蛋白酶的开发利用提供理论指导。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供了一种海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）。本专利技术目的之二是提供了一种海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）SWJS44在液体发酵生产蛋白酶的应用。本专利技术中可生产蛋白酶的深海菌株，为海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）SWJS44，该菌于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.7389。对保藏号为CGMCCNo.7389的菌株进行形态学及生理生化鉴定，有以下特征：（1）菌落形态：橙色，呈椭圆形，表面光滑，低凸起，不透明，边缘整齐；（2）细胞形态：直杆状，链状排列，周生鞭毛，革兰氏阳性；（3）：生理生化特征：生长温度为4-40℃，好氧，能耐受7%（wt）氯化钠，能水解明胶、淀粉、酪素，能利用硫酸铵、硝酸铵，可利用果糖、葡萄糖、甘露醇为碳源，不能利用木糖，吲哚反应为阴性性，甲基红试验、接触酶和氧化酶试验为阳性，不产过氧化氢、硫化氢。保藏号为CGMCCNo.7389菌株经16SrDNA鉴定，测得基因片段长度为1295bp，具体基因序列见序列表。将获得的基因序列输入Genbank，应用Blast程序将获得的基因序列与数据库中基因序列进行对比。结果显示与海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）的16SrDNA序列的同源性为99%。将此结果结合菌株形态学及生理生化鉴定特征，确定该菌为海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）。保藏号为CGMCCNo.7389菌株通过单因素试验对其液体发酵产蛋白酶条件进行了优化。本专利技术公开了海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）SWJS44产蛋白酶的条件，其培养、发酵条件简单，遗传性质稳定。由于该菌株来源于深海，所分泌蛋白酶具有特殊的性质，并且关于该菌株的文献报道较少，在开发新型深海菌株及酶制剂的研究中，具有重要意义。附图说明图1为不同种子液培养时间对海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）SWJS44产蛋白酶的影响曲线。图2为不同装液量对海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）SWJS44产蛋白酶的影响曲线。图3为不同发酵温度对海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）SWJS44产蛋白酶的影响曲线。图4为不同发酵时间对海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）SWJS44产蛋白酶的影响曲线。具体实施例富集及种子培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，硫酸铁0.1g，人工海水1L，pH7.6-7.8。酪蛋白培养基：酪蛋白10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2g，琼脂15g，去离子水L，pH7.3-7.5。发酵培养基：麦芽糖5g，酵母粉10g，氯化钙2.8g，氯化钠1g，SE1701.5g，去离子水1L，pH7.5。编号CGMCCNo.7389菌株的分离、筛选细菌的富集：取少许海泥于含无菌去离子水的锥形瓶中，加入几粒无菌玻璃珠，37℃、150rpm摇床中分散30min。吸取1ml上清液接种于富集培养基中（25ml/250ml），37℃、150rpm摇床中培养24h。初筛：取1ml富集液适当稀释后涂布于酪蛋白培养基上。若细菌产蛋白酶，在菌落周围出现透明水解圈，根据水解圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D／d)大小确定产蛋白酶能力较强的菌株。分离纯化：挑取D／d比值较大的菌株，连续划线分离三次以上，得纯培养物。将其于接种于斜面上，4℃保藏。复筛：将上述保藏的菌株接种于种子培养基中，37℃，150r/min，活化12h后，以1%的接种量接种于发酵培养基中（25ml/250ml），发酵培养48h。将发酵完成液于4℃，10000r/min条件下高速离心10min,过滤得上清液，即粗酶液。采用福林-酚法测发酵液中性蛋白酶酶活，筛选出酶活较高的菌株。编号CGMCCNo.7389菌株的鉴定将活化的编号CGMCCNo.7389的菌株接种于L-B培养基中，37℃，150r/min培养12h，经L-B培养液传代培养2-3次后，取1.5mL对数生长末期的菌体培养物，4℃，10000r/min离心5min，收集菌体，去尽培养液。菌体经SDS及蛋白酶K裂解、酚-氯仿-异戊醇抽提、转移上清、0.6倍体积异丙醇析出DNA沉淀后短暂离心、70%乙醇洗涤、TE溶解模板DNA。电泳检测后采用通用引物进行PCR（正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,反向引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。扩增总反应体系为（20μL）:模板基因DNA0.5μL；上下游引物(20μmol/l)各1.0μL；TaqDNA聚合酶0.2μL；10×buffer2.0μL；4种脱氧核苷酸混合物dNTP(各2.5mmol/L)1.6μL，25mmol/LMgCl21.6μL，双蒸水(ddH2O)12.1μL。PCR扩增条件：95℃5min；95℃30s；55℃30s；72℃1.5min；72℃10min；10℃，共30个循环。PCR产物纯化后完成测定的16SrDNA基因基因片段长度为1295bp，与Bacillusaquimarisstrain相似性最高，同源性达99%，具体序列见序列表。结合菌株形态学、生理生化特征，判定编号CGMCCNo.7389的菌株为海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）。海水芽孢杆菌CGMCCNo.7389液体发酵产蛋白酶条件优化种龄的优化：将菌株接种于种子液中，37℃，150r/min，分别培养4h、8h、12h、16h、24h后，接种于发酵培养基发酵48h，测定其酶活。结果见图1。种龄对发酵液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株海水芽孢杆菌（Bacillus?aquimaris）SWJS44，该菌于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.7389。

【技术特征摘要】
1.一株海水芽孢杆菌（Bacillusaquimaris）SWJS44，该菌于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔春，赵谋明，钟泓波，赵强忠，苏国万，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：