一种多杀菌素的补料发酵及分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种多杀菌素的补料发酵及分离纯化方法，发酵方法包括如下步骤：（1）将能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104经斜面培养、种子培养，得到种子液；（2）将种子液接种到发酵培养基中，发酵168-288h，在发酵0-140h时，一次性补加混合油脂和玉米浆，再在141-150h第二次补加玉米浆，所述混合油脂是由按质量比为0.5-4:1的油酸甲酯和植物油组成，发酵结束，得到补料发酵液。本发明专利技术的方法多杀菌素产量较高，达到804.59mg/L，比未进行补料的对照组提高了108.42%。产品纯度高达95.43%，泄漏率较低，收率达87.0%。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，发酵方法包括如下步骤：（1）将能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104经斜面培养、种子培养，得到种子液；（2）将种子液接种到发酵培养基中，发酵168-288h，在发酵0-140h时，一次性补加混合油脂和玉米浆，再在141-150h第二次补加玉米浆，所述混合油脂是由按质量比为0.5-4:1的油酸甲酯和植物油组成，发酵结束，得到补料发酵液。本专利技术的方法多杀菌素产量较高，达到804.59mg/L，比未进行补料的对照组提高了108.42%。产品纯度高达95.43%，泄漏率较低，收率达87.0%。【专利说明】
本专利技术属于发酵工程
，具体涉及多杀菌素的发酵及分离纯化方法。
技术介绍
多杀菌素(spinosad)是由土壤放线菌刺糖多抱菌(Saccharopolysporaspinosad)产生的次级代谢产物，属于大环内酯类化合物，主要有效成分为多杀菌素A和D，分别占所有组分的85-90%和10-15%。多杀菌素作为一种新型的微生物源杀虫剂，具有毒力高、杀虫谱广、作用方式独特、残留低、环境友好、对人畜无害等特性，应用前景十分广阔。目前，制约多杀菌素实现产业化和广泛应用的主要问题在于生产成本高，发酵工艺复杂，发酵效能低。优化培养条件及分离纯化工艺，从而提高发酵效价、降低生产成本是目前促进多杀菌素产业化的研究重点。研究表明，植物油可以提供抗生素合成的前体和能量，对抗生素的合成有促进作用。发酵后期由于碳源或溶氧的限制，菌体自溶，PH上升。在发酵中后期补加混合油脂，油脂分解产生脂肪酸中和0H-，使得发酵中后期的pH基本稳定在7左右。恒定的pH环境及大量的前体物质会大大促进多杀菌素的合成，在发酵过程中补加油脂是过程补料的重要内容。对于多杀菌素的分离纯化，据国内文献报道，王琨等用DMll树脂在pH为9.5时吸附多杀菌素，并用丙酮解吸，回收率高达85.8%。夏立秋等利用萃取与反萃取相结合的技术路线进行多杀菌素的提取，总收率达到80%以上。中国专利CN101560231中公开了一种大孔树脂梯度洗脱的提取工艺，收率达到68.2%，纯度达到95.3%。但是，目前树脂吸附法的工艺研究尚不完善，已有的树脂 吸附法的报道中，普遍存在泄漏率较高、产品收率及纯度较低的问题。本领域迫切需要深入研究并优化多杀菌素的发酵工艺和分离纯化工艺，有效提高多杀菌素产量并降低生产成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种多杀菌素的补料发酵方法。本专利技术的第二个目的是提供一种多杀菌素的补料发酵液的分离纯化方法。本专利技术的技术方案概述如下:一种多杀菌素的补料发酵方法，包括如下步骤:(I)将能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104经斜面培养、种子培养，得到种子液；(2)将种子液以接种量5%-15%的比例接种到发酵培养基中，于30°c、200-250rpm发酵168-288h，在发酵0-140h时，一次性补加混合油脂和玉米浆，使混合油脂的质量浓度为1_4%，使玉米浆质量浓度为0.5-3%，再在141-150h第二次补加玉米浆，使第二次补加玉米浆的质量浓度为0.5-3%，所述混合油脂是由按质量比为0.5-4:1的油酸甲酯和植物油组成，发酵结束，得到补料发酵液。优选的是发酵培养基组份按g/L计:葡萄糖50-70、麦芽糖5-20、豆油15_30、棉籽蛋白 20-30、豆粉 5-15、酵母膏 10-25，K2HPO40.5-2, NaCl0.5-2, MgS042_3，CaC035_7，余量为水，pH=7.5-8.0。步骤(2)优选为:将种子液以接种量10%的比例接种到发酵培养基中，于30°C、220rpm发酵240h，得到补料发酵液；在发酵96h时，一次性补加混合油脂和玉米浆，使混合油脂的质量浓度为3%，使玉米浆质量浓度为1%，再在144h第二次补加玉米浆，使第二次补加玉米浆的质量浓度为1%，所述混合油脂是由按质量比为2:1的油酸甲酯和植物油组成。植物油优选为菜籽油、玉米油、花生油、大豆油或葵花籽油。一种多杀菌素的补料发酵液的分离纯化方法，包括如下步骤:(I)按体积比为1:0.5-1.5的比例，向补料发酵液中加入等体积的丙酮，混匀后于无光照条件下静止18-30h，离心后保留上清液；(2)将上清液调pH至10-11，以40_70mL/h的流速过大孔树脂进行动态吸附；分别用去离子水和体积浓度为30%-95%的丙酮水溶液进行梯度洗脱；(3)收集体积浓度为95%的丙酮水溶液的洗脱液进行超滤、纳滤，得到浓缩液；(4)用乙酸乙酯萃取浓缩液，用旋转蒸发蒸去乙酸乙酯后得到多杀菌素。大孔树脂的型号优选为:D3520、HDP300、DlOl、X-5、HDP100或 NKA。本专利技术的方法多杀菌素产量较高，达到804.59mg/L,比未进行补料的对照组提高了 108.42%。产品纯度高达95.43%，泄漏率较低，收率达87.0%。【专利附图】【附图说明】图1为重组质粒构建过程图。`图2是重组质粒pLUlOl的质粒图谱。图3是重组质粒pLU102的质粒图谱。图4是重组质粒pLU104的质粒图谱。图5是多杀菌素野生菌株与多杀菌素基因工程菌发酵结果。图6是重组质粒pLUlOl验证电泳图。图7是重组质粒pLU102验证电泳图。图8是重组质粒pLU104验证电泳图。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。但本专利技术的保护范围不能认为仅局限于下述【具体实施方式】，在不脱离本专利技术基本构思的前提下，所属领域的技术人员据此作出的简单推演或同等替换方案，均属于本专利技术的保护范围。各实施例的斜面培养基组分按g/L计为酪蛋白胨2.5，葡萄糖5，牛肉膏3，琼脂20，硫酸镁2，余量为水，灭菌前pH=7.5。种子培养基组分按g/L计:葡萄糖10，N-Z-Amine A (酸水解酪蛋白)30，酵母膏1.0，牛肉膏1.0, MgS042.0，余量为水，灭菌前pH=7.3。实施例11.基因元件克隆和含有对应基因原件的质粒构建将包含ermE*启动子(SEQ ID N0.23)的pIB139质粒用HindIII和XbaI酶切消化，所用酶为Fermentas Fast Taq限制性内切酶,酶切体系如下:目的DNA片段30ng,加入2μ LlOXbuffer，限制性内切酶HindIII和XbaI各I μ L(内切酶最后加入)，补充蒸馏水至20 μ L0将酶切体系置于37°C 30min，得到0.3kb的包含ermE*启动子的HindIII/Xbal片段。将该HindIII/Xbal片段插入质粒p0J260，得到pOJ261质粒。用引物对spnK-F-Ndel (SEQ ID N0.1)和 spnK-R-Xbal (SEQ ID N0.2)从刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa) ATCC49460 (以下简称刺糖多胞菌 ATCC49460)染色体中获取spnK基因序列并扩增，再用Ndel和Xbal酶切消化spnK的PCR产物。随后将处理过的片段插入到同样被Ndel和Xbal酶切消化的p0J261质粒中，得到重组pLUlOl质粒，质粒验证见图6。本专利技术所用per酶为北京全式金生物技术有限公司的pfu聚合酶，PCR扩增体系如下:依照下述在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多杀菌素的补料发酵方法，其特征是包括如下步骤：（1）将能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104经斜面培养、种子培养，得到种子液；（2）将种子液以接种量5%‑15%的比例接种到发酵培养基中，于30℃、200‑250rpm发酵168‑288h，在发酵0‑140h时，一次性补加混合油脂和玉米浆，使混合油脂的质量浓度为1‑4%，使玉米浆质量浓度为0.5‑3%，再在141‑150h第二次补加玉米浆，使第二次补加玉米浆的质量浓度为0.5‑3%，所述混合油脂是由按质量比为0.5‑4:1的油酸甲酯和植物油组成，发酵结束，得到补料发酵液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卢文玉，王美玲，尹静，赵方龙，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12