本发明专利技术公开了一种利用原料预处理和补料发酵生产高酶活碱性果胶酶的方法，是通过对补料培养基中的淀粉进行液化处理和补料分批发酵实现。本发明专利技术方法明显提高了碱性果胶酶的单位体积酶活力和容积生产效率。通过对补料培养基中淀粉原料进行淀粉酶液化处理，大大降低了料液的粘滞系数，提高搅拌效率。通过补料发酵延长菌体对数生长期，提高了生物量。经实验检测，本方法得到了聚半乳糖裂解酶活力为531U?mL-1的碱性果胶酶粗酶液，最高容积生产效率达到13U(mL·h)-1。本发明专利技术方法还具有成本低廉、发酵周期短、设备利用率高、工艺简单，适于规模化工业生产的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生产高酶活碱性果胶酶的方法，尤其涉及一种通过对补料培养基中的淀粉进行液化处理和补料分批发酵生产高酶活碱性果胶酶的方法，属于生物酶制备
技术介绍
果胶酶(pectinases)是一类可分解植物细胞壁组分果胶质的酶系总称，从分解方式上可以将果胶酶分为果胶水解酶和果胶裂解酶，前者主要包括原果胶酶(PPase)、果胶酯酶(PE)、低聚半乳糖醛酸水解酶、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、聚半乳糖醛酸酶(PG);后者主要包括聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶( PMGL)。人们常称的碱性果胶酶一般指果胶裂解酶中的聚半乳糖醛酸裂解酶。果胶裂解酶通过反式消去作用裂解果胶聚合体，在C-4位置上断开糖苷键，同时在C-5处消去一个H原子。从而产生一个A4:5不饱和键。目前对于果胶酶的研究已有大量的文献报道，其中研究时间较长的酸性果胶酶主要用于果胶组分的提取和果酒果汁的澄清，碱性果胶酶在制浆漂白，棉织物处理工艺中的应用取得了一定进展，特别是在麻类纤维的脱胶上的应用研究日趋增多。原麻是一种被各种胶质粘接在一起的片条状物，单纤维不易分开，因此在梳理纺纱之前必须对原麻进行脱胶处理。长期以来的脱胶方式主要是化学脱胶，其基本原理是利用原麻中纤维素和胶质成分对碱、无机酸和氧化剂的稳定性不同以去除原麻中的胶质成分。该方法的缺点在于剧烈的化学处理可能导致麻纤维受损，影响麻织物的优良品质，同时消耗大量的化工原料和热能，造成严重的环境污染。近年来，生物脱胶受到了较多的关注，其主要包括微生物脱胶，酶脱胶和生物-化学联合脱胶。其中酶脱胶因具有操作灵活性强，过程容易控制，便于添加脱胶助剂等优势而成为研究的重点。在碱性果胶酶的生产方面，日本学者Koki Horkoshi于1972年首次报道了嗜碱细菌可分泌碱性果胶酶，Junwei Cao, T. SaKai, Tohru Kobayashi等也相继分离筛选到产碱性果胶酶的菌株。我国从90年代初开始对碱性果胶酶进行了研究，已经报道的产生菌包括欧文氏菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、螺孢菌等，但研究工作主要停留在菌种筛选及对酶学性质的研究；在碱性果胶酶的发酵研究方面，大多停留在摇瓶条件优化，小型发酵罐产酶条件的初步优化研究上。刘曦等对高产碱性果胶酶枯草芽孢杆菌的产酶条件进行了优化，使酶活力提高到了 14. 82U mL—1 (碱性果胶酶高产菌株产酶条件的优化.生物技术，2008，18(6) :71-74.)。蒋红菊等对多粘类芽孢杆菌发酵产碱性果胶酶的培养基及发酵培养条件进行了优化，使酶活达到311U ml/1 (多粘类芽孢杆菌20185液态发酵产碱性果胶酶发酵条件的研究.中国酿造，2011,235:111-114.)。董云舟等在小型发酵罐中采用温度控制策略对碱性果胶酶进行发酵优化，使芽孢杆菌WSH03-09产碱性果胶酶的酶活达5. 99U mL—1 (芽孢杆菌发酵产碱性果胶酶温度控制策略.应用与环境生物学报，2005，11 (3) :359-362.)。刘慧娟等研究了不同温度(32-41。。)对芽孢杆菌WSHB04-02分批发酵生产碱性果胶酶动力学參数的影响，温度优化后可使碱性果胶酶的酶活达到53. OU mじ1，生产强度为3315U (h · L)—1 (芽孢杆菌发酵生产碱性果胶酶的温度控制策略·过程工程学报，2007，7(4) :786-789.)。中国专利ZL 03131952. I公开了ー株产碱性果胶酶的短小芽孢杆菌，液体深层发酵得到碱性果胶酶酶活力为ZOUmr1 ;中国专利ZL200410065807. X公开了ー种通过氧气在发酵液中的传递速率体积溶氧系数(1(卢)提高碱性果胶酶活力的方法，其酶活力达到了 40U mじ1。但上述报道的碱性果胶酶活力与エ业化要求还有一段距离。李祖明等对克劳氏芽孢杆菌进行了紫外诱变育种和固态发酵条件优化(高产碱性果胶酶菌株的育种及其发酵条件的研究.エ业微生物，2008, 38(3) :27-31.);中国专利 ZL 94105708. 9、CN 101096650B、ZL 200410073818. 2、CN 101235361A 公开了不同菌株固体发酵生产碱性果胶酶的方法，由于酶活力測定方法不一，产酶能力无法直观比较；同时也因为固体发酵设备要求高、エ艺复杂而鲜见其应用于エ业生产。ZL97109044公开了ー株嗜碱芽孢杆菌及其苎麻脱胶的方法，但由于脱胶时间长(16_24h)，果胶酶活力低也难于エ业化应用。ZL01106844. 2公开了ー株碱性果胶酶生产菌CCTCC N0:M200038，并将发酵所得酶液应用于苎麻脱胶，由于其发酵酶活力较低而未能应用于エ业化生产。因此进ー步优 化生产エ艺，通过发酵エ艺控制和优化提高碱性果胶酶酶活力和容积生产效率，降低碱性果胶酶的生产成本，是技术开发和工程放大的关键，也是促进碱性果胶酶エ业化应用的前堤。特别是对于高浓度底物的液体深层发酵エ艺优化和控制显得尤为重要。目前高产量的碱性果胶酶的报道多采用固体发酵(高底物浓度)，但其后续分离纯化过程复杂，酶蛋白得率较低，增加了生产成本。而高浓度底物液体深层发酵生产碱性果胶酶存在搅拌效率低,传质效果差等问题。补料发酵技术在降低初发酵液底物浓度和延长发酵产酶时间中得到了广泛的应用，其对发酵中后期细胞生长分裂、细胞活力的維持起到了重要作用，可有效提高或者稳定酶蛋白产量。在检索到的相关方法中，关于通过对原料进行预处理和补料发酵生产碱性果胶酶的方法还未见报道。
技术实现思路
针对现有技术中，液体发酵产生的碱性果胶酶活力低，成本高，不适合エ业化生产的不足，本专利技术的目的是提供ー种。本专利技术所述的，是通过对补料培养基中的淀粉进行液化处理和补料分批发酵提高碱性果胶酶酶活力及其生产效率，其步骤如下(I)种子培养在无菌的条件下，活化斜面菌种枯草芽孢杆菌CCTCC N0:M200038,并接种至50ml种子培养基中进行种子培养，36-37°C摇床震荡培养7_9h ；(2)初发酵将种子培养液接种至装有发酵培养基的7. 5L发酵罐,进行发酵培养，发酵罐装液量3-4L，接种量10%，温度33-34°C，通气量2. 5-4. 5L mirT1 ；(3)补料培养基中的淀粉预处理用中温淀粉酶对补料培养基中的淀粉进行液化处理，加酶量为20-45U g'液化温度为45-65°C，液化时间为20_40min ；(4)补料发酵初发酵至13_19h，按初发酵培养基体积量10-25%补加预处理后的补料培养基，继续发酵，温度为33-34°C，通气量2. 5-4. 5L min—1，发酵周期为36_48h ；(5)粗酶液制备发酵完毕后，将发酵液12000rpm离心lOmin，上清液即为含有碱性果胶酶的粗酶液；上述种子培养基组成是葡萄糖8_13gじ1，酵母粉3_6gじ1，蛋白胨3_6gじ1，NaCl3-6g じ1，K2HPO4 8-12g じ1，pH 8. O ；上述发酵培养基组成是淀粉15_25gじ1，麦麸35_45gじ1，(NH4)2SO4 l_2gじ1，MgSO4 · 7H20 O. 5-1. 5g じ1 ；上述补料培养基组成是淀粉110-135gじ1，麦麸8-13g Λ (NH4)2SO4 6本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种利用原料预处理和补料发酵生产高酶活碱性果胶酶的方法，步骤是 (1)种子培养在无菌的条件下，活化斜面菌种枯草芽孢杆菌CCTCCN0:M200038,并接种至50ml种子培养基中进行种子培养，36-37°C摇床震荡培养7_9h ； (2)初发酵将种子培养液接种至装有发酵培养基的7.5L发酵罐，进行发酵培养，发酵罐装液量3-4L，接种量10%，温度33-34°C，通气量2. 5-4. 5L min—1 ； (3)补料培养基中的淀粉预处理用中温淀粉酶对补料培养基中的淀粉进行液化处理，加酶量为20-45U g'液化温度为45-65°C，液化时间为20_40min ； (4)补料发酵初发酵至13-19h，按初发酵培养基体积量10-25%补加预处理后的补料培养基，继续发酵，温度为33-34°C，通气量2. 5-4. 5L min—1，发酵周期为36_48h ； (5)粗酶液制备发酵完毕后，将发酵液12000rpm离心lOmin，上清液即为含有碱性果胶酶的粗酶液； 上述种子培养基组成是葡萄糖8-13g L—1，酵母粉3-6g L—1，蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹谋勇，李雪芝，赵建，曲音波，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
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