ABCB1基因多态性焦磷酸测序方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种用于检测ABCB1基因多态性的焦磷酸测序检测方法及试剂盒。本发明专利技术对ABCB1基因多态性检测具体是指多态性位点rs1128503，rs2032582和rs1045642的单核苷酸多态性。本发明专利技术从核酸提取到完成多态性检测报告，全程只需5小时，可以快速、准确、高通量对ABCB1基因进行定性定量检测，指导患者的个性化用药。

【技术实现步骤摘要】
ABCB1基因多态性焦磷酸测序方法及试剂盒所属
本专利技术属于生物
，具体地，涉及一种ABCBl基因多态性焦磷酸测序方法及试剂盒。
技术介绍
ABCBl转运蛋白家族是一类跨膜蛋白，其主要功能是利用ATP水解产生的能量将与其结合的底物等主动转出质膜，ABCBl基因在人类多药耐药基因族中起主导作用，其表达受各种因素的影响，属于可调控基因。研究显示与ABCBl的基因表达、蛋白结合能力影响较大的3个单核苷酸多态性分别为:rsll28503，rs2032582和rsl045642。ABCBl定位于人类7号染色体q21.1，由28个外显子组成，编码一个170kDa的跨膜糖蛋白-P糖蛋白。它是人体内重要的转运蛋白之一，在胃肠道、肝脏、肾脏、脑等重要组织器官广泛分布，参与多种药物的吸收、分布及分泌和排泄。ABCBl是一种能量依赖性药物输出泵，当化疗药物靠浓度梯度到达细胞后与ABCBl蛋白结合，导致ATP结合区活化，此时其核苷酸结合位点与ATP结合，ATP随即水解为ADP释放能量，在Mg2+作用下使P糖蛋白形态发生变化，在药物尚未发生细胞毒作用之前被转移至细胞外，使细胞内药物浓度降低，于是作用到药物靶位细胞核位置的药物浓度相对降低而产生多药耐药。rs2032582是位于ABCBl外显子上第893位密码子上G到T / A突变，导致893位丙氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸，生化分析证实这种突变会影响药物转运。GG野生型细胞内的钼类药物浓度高于突变型，导致细胞死亡和严重的中心粒细胞毒性。在美国前列腺癌人群中被发现该位点和rsl045642的多倍型与多西紫杉醇治疗的中性粒细胞毒性的显著相关。氯吡格雷是一种新型噻吩吡啶类的抗血小板药物，氯吡格雷为药物前体，本身无活性，氯吡格雷约50%经胃肠道吸收后在肝脏内迅速代谢，血浆中原形药物浓度极低。氯吡格雷在小肠的吸收受到ABCBl基因编码的质子泵P糖蛋白调控。研究表明ABCBl基因rsll28503,rs2032582和rsl045642三者存在连锁不平衡关系含有两个ABCB1C3435T等位基因变异体可降低氯吡格雷的血药浓度。在对白种人中研究时发现携带3435TT突变型纯合子基因型个体的P糖蛋白的表达量比正常野生型个体低51 %。FAST-MI研究显示携带两个ABCB1C3435T等位基因的患者比没有携带的主要终点事件(死亡，非致命性卒中、心肌梗死等)的风险高。在接受氯吡格雷治疗的患者中，ABCB13435C —T基因型与心血管死亡、心肌梗死及卒中等事件风险呈显著相关(P=0.0064)，与ABCBl基因型3435CT / CC携带者相比，纯合子TT携带者主要终点事件风险增加72% ;在健康人群中，纯合子3435TT携带者应用氯吡格雷后血小板最大聚集率出现绝对降低，但降幅较CT / CC携带者减小7.3%(P=0.0127)。ABCBl基因型3435TT携带者降低了对血小板的抑制，且在氯吡格雷治疗期间复发性缺血事件的风险有所增加。焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)作为一种新的序列分析技术,相对传统的Sanger测序法，焦磷酸测序更快、更简单，且便宜得多。焦磷酸测序方法由4种酶催化同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就能将其加入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由Pyrogram TM转化为一个峰值,其高度与核苷酸数目成正比。其操作简单，结果准确可靠，可以行大规模分析。基于以上所述，本专利技术采用焦磷酸测序对ABCBl基因的三个多态性位点进行检测，对进行化疗的肿瘤患者或接受氯吡格雷治疗的患者提供个性化治疗方案提供决策依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一组用于检测ABCBl基因多态性位点rsl 128503的核苷酸序列。本专利技术的目的在于，提供一种用于检测ABCBl基因多态性位点rs2032582的核苷酸序列。本专利技术的目的 在于，提供一种用于检测ABCBl基因多态性位点rsl045642的核苷酸序列。本专利技术的目的在于，提供一种用于检测ABCBl基因多态性位点rsll28503、rs2032582和rs 104564的焦磷酸测序方法及试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案:一组用于检测ABCBl基因多态性位点rsll28503、rs2032582和rsl045642的焦磷酸测序方法中使用的PCR引物及测序引物，其特征在于，其组成为:检测rsll28503的PCR引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，测序引物如序列表SEQ ID N0.3所示；检测rs2032582的PCR引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示，测序引物如序列表SEQ ID N0.6所示；检测rsl045642的PCR引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示，测序引物如序列表SEQ ID N0.9所示；一组用于检测ABCBl基因多态性位点rsll28503、rs2032582和rsl045642的焦磷酸测序方法中使用的核酸，其特征在于，该组核酸包括核苷酸序列分别如序列表SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2所示的用于rsll28503PCR扩增的引物对和测序引物SEQ ID N0.3、如序列表SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示的用于rs2032582PCR扩增的引物对和测序引物SEQ ID N0.6、如序列表SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的用于rsl045642PCR扩增的引物对和测序引物SEQ ID N0.9和携带有SEQ ID N0.10所示的阳性对照。一种用于检测ABCBl基因多态性位点rsll28503、rs2032582和rsl045642的焦磷酸测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:PCR 缓冲液；用于rsll28503PCR扩增上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，测序引物如SEQ ID N0.3所示；用于rs2032582PCR扩增上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.5，所示测序引物如SEQ ID N0.6所示;用于rsl045642PCR扩增上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示，下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示，测序引物如SEQ ID N0.9所示；；dNTP ；MgCl2 ；Pfu DNA 聚合酶；双蒸水；阴性对照:灭菌生理盐水；阳性对照:所述质粒携带的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示。一种用于检测ABCBl基因多态性位点rsll28503、rs2032582和rsl045642的焦磷酸测序方法:(I)样品采集、核酸提取:本专利技术可检测本专利技术可检测血液和组织切片等样本；采集到的血液样本首先通过蛋白酶K消化、裂解之后用氯仿抽提提取核酸或采用商品化试剂盒提取核酸。(2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组检测ABCB1基因多态性焦磷酸测序方法中使用的引物，其特征在于，其组成为：检测ABCB1基因多态性位点rs1128503的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其中下游引物SEQ ID No.2所示引物5’端采用生物素标记，ABCB1基因的焦磷酸测序引物，如SEQID No.3所示。

【技术特征摘要】
1.一组检测ABCBl基因多态性焦磷酸测序方法中使用的引物，其特征在于，其组成为:检测ABCBl基因多态性位点rsll28503的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，其中下游引物SEQ ID N0.2所示引物5’端采用生物素标记，ABCBl基因的焦磷酸测序引物，如SEQID N0.3所示。2.一组检测ABCBl基因多态性焦磷酸测序方法中使用的引物，其特征在于，其组成为:检测ABCBl基因多态性位点rs2032582的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQID N0.4和SEQID N0.5所示，其中下游引物SEQ ID N0.5所示引物5’端采用生物素标记，ABCBl基因的焦磷酸测序引物，如SEQID N0.6所示。3.—组检测ABCBl基因多态性焦磷酸测序方法中使用的引物，其特征在于，其组成为:检测ABCBl基因多态性位点rsl045642的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQID N0.7和SEQID N0.8所示，其中下游引物SEQ ID N0.2所示引物5’端采用生物素标记。ABCBl基因的焦磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：山东博思源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37