本发明专利技术公开了一种用于诊断口蹄疫病毒的引物、探针及其试剂盒和使用方法。其中，O型、AsiaI型、A型、C型口蹄疫病毒共用一条上游引物，SAT1型、SAT2型、SAT3型口蹄疫病毒共用一条上游引物，所有血清型口蹄疫病毒共用一条下游引物，各血清型口蹄疫病毒分别采用对应的型特异性探针。所述试剂盒由PCR和反向斑点杂交反应试剂及材料构成，可在室温下进行O型或者AsiaI型或者A型或者C型或者SAT1型或者SAT2型或者SAT3型口蹄疫病毒或者其中两种或者三种或者四种或者五种或者六种或者七种血清型口蹄疫病毒分型诊断，降低了传统杂交技术对温度的要求，缩短了反应时间，提供了一种简便、快速的口蹄疫病毒诊断技术。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种用于诊断口蹄疫病毒的引物、探针及其试剂盒和使用方法。其中，O型、AsiaI型、A型、C型口蹄疫病毒共用一条上游引物，SAT1型、SAT2型、SAT3型口蹄疫病毒共用一条上游引物，所有血清型口蹄疫病毒共用一条下游引物，各血清型口蹄疫病毒分别采用对应的型特异性探针。所述试剂盒由PCR和反向斑点杂交反应试剂及材料构成，可在室温下进行O型或者AsiaI型或者A型或者C型或者SAT1型或者SAT2型或者SAT3型口蹄疫病毒或者其中两种或者三种或者四种或者五种或者六种或者七种血清型口蹄疫病毒分型诊断，降低了传统杂交技术对温度的要求，缩短了反应时间，提供了一种简便、快速的口蹄疫病毒诊断技术。【专利说明】
本专利技术涉及一种用于病毒分型诊断的引物、探针及其试剂盒和使用方法，尤其涉及一种用于诊断O型、AsiaI型、A型、C型、SATl型、SAT2型、SAT3型口蹄疫病毒的引物、探针及其试剂盒和使用方法，属于口蹄疫病毒检测领域。
技术介绍
口蹄疫(Food and Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Food and MouthDisease Virus7FMDV)感染引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病，主要感染偶蹄类动物，如猪、牛、羊等。口蹄疫一旦暴发,将会给畜牧养殖业,尤其是进出口贸易造成巨大损失，因此该病也被世界动物卫生组织(OIE)列为15个A类动物疫病之首，我国政府也将FMD排在14个一类动物传染病的第一位。口蹄疫病毒有七种血清型，其中O型和A型分布最广，除欧洲外，在非洲、南亚、中东和南美许多地区也有发生，C型仅局限于印度次大陆，AsiaI型通常只发生在亚洲，STAU2、3型只见于非洲地区，在我国曾出现过O型、A型和AsiaI型的疫情。七种血清型的主要区别在于其结构蛋白氨基酸组成数与排列顺序的不同引起的蛋白二级结构的差异，其中VPl基因最容易发生变异，不同血清型之间的变异率约为30% -50%，其次是VP3和VP2。口蹄疫病毒血清型分类最早是在1922年，由法国学者Vallee和Carre通过田间重复感染现象的观察和交叉免疫试验发现的，1997年，我国台湾FMD大流行时曾致使新生仔猪的死亡率高达100%，造成了重大的经济损失。目前，口蹄疫的实验室诊断方法主要包括病原生物学方法、免疫学方法和分子生物学方法三大类。其中，病原生物学方法和免疫学方法对实际样品具有一定的依赖性，灵敏度不高，尤其是对于免疫动物、感染并有症状动物与已感染但尚未出现发病症状动物难以进行区分和及时有效的判断，而基于核酸检测的分子生物学方法可从根本上解决这一难题，具有特异性强、灵敏度高等特点。因此，实时荧光定量PCR核酸分子诊断方法成为口蹄疫病毒诊断的标准方法。然而，现有标准方法只针对通用型口蹄疫病毒检测，不能对口蹄疫病毒进行分型鉴别，需在实验室操作，检测周期较长。反向斑点杂交(reversedot blot, RDB)是1985年由Saiki等提出的一种斑点杂交技术，并将其应用于血液病和Beta地中海贫血的检测，RDB只需要相对较短的寡核苷酸探针就能提供明显的杂交信号，通过调整杂交条件可以鉴别出模板中一个碱基的差异。该技术较正向斑点杂交和凝胶电泳转印杂交具有快速、简便、敏感性高、特异性强的特点，尤其是在基因分型、基因突变检测、病原体的检测等方面有其独特的优势，但是传统的杂交技术都需要再高温条件下进行，需要一定的仪器设备的支持，在实地应用的过程中仍然会受到一定的限制。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一套用于分型诊断口蹄疫病毒的引物和探针，可用于O型或者AsiaI型或者A型或者C型或者SATl型或者SAT2型或者SAT3型的口蹄疫病毒或者其中的两种或者三种或者四种或者五种或者六种或者七种血清型口蹄疫病毒的聚合酶链反应-反向斑点杂交分型诊断。所述引物针对各血清型的保守片段设计，O型、AsiaI型、A型、C型四种口蹄疫病毒共用一条上游引物(SEQ N0.1)、SATl型、SAT2型、SAT3型三种口蹄疫病毒共用一条上游引物(SEQ N0.2)，七种口蹄疫病毒共用一条下游引物(SEQN0.3)，引物5’端均使用生物素进行标记，其核苷酸序列为:【权利要求】1.一套用于分型诊断口蹄疫病毒的引物及探针，其特征在于，所述引物针对各血清型口蹄疫病毒的保守片段设计，O型、AsiaI型、A型、C型四种口蹄疫病毒共用一条通用上游引物(SEQ N0.1)、SATl型、SAT2型、SAT3型三种口蹄疫病毒共用一条通用上游引物(SEQN0.2)，O型、AsiaI型、A型、C型、SATl型、SAT2型、SAT3型七种口蹄疫病毒共用一条通用下游引物(SEQ N0.3)，引物5’端均以生物素标记，其核苷酸序列为: 2.一种用于分型诊断口蹄疫病毒的试剂盒，其特征在于，包括O型、AsiaI型、A型、C型四种口蹄疫病毒通用PCR上游引物溶液(PMl)，SATl型、SAT2型、SAT3型三种口蹄疫病毒通用PCR上游引物溶液(PM2)，固定有各血清型口蹄疫病毒探针的尼龙杂交膜(chip)，室温杂交液(Hyb)，洗液I (Wl)，洗液II (W2)，碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(AP)，碱性磷酸酶缓冲液(Bufferl)，显色底物(NBT/BCIP)，显色缓冲液(Buffer2)和聚合酶链式反应预混合液(RM)，其特征在于，所述试剂盒可以进行O型或者AsiaI型或者A型或者C型或者SATl型或者SAT2型或者SAT3型口蹄疫病毒或者其中的两种或者三种或者四种或者五种或者六种或者七种血清型口蹄疫病毒的分型诊断。 所述的O型、AsiaI型、A型和C型四种口蹄疫病毒通用PCR上游引物溶液(PMl)，其特征在于，是由如权利要求1所述的上引物(SEQ N0.1)与下引物(SEQ N0.3)按照1:1的比例配制而成的，引物浓度为ΙΟμπιοΙ/L ;所述的SATl型、SAT2型和SAT3型三种口蹄疫病毒通用PCR上游引物溶液(PM2)，其特征在于，是由如权利要求1所述的上游引物(SEQ N0.2)与下引物(SEQ N0.3)按照1:1的比例配制而成的，引物浓度为ΙΟμπιοΙ/L;所述的固定有各血清型口蹄疫病毒探针的尼龙杂交膜(chip)，其特征在于，固定有如权利要求1所述的七种分型诊断口蹄疫病毒探针(SEQ N0.4,SEQ N0.5、SEQ N0.6、SEQ N0.7、SEQ N0.8、SEQN0.9,SEQ N0.10)中至少一种探针，同时设置带生物素标记的核苷酸序列为阳性对照，设置DEPC水为阴性对照，各血清型口蹄疫病毒探针的点样浓度为50-100μπιΟ1/1，优选浓度为.100 μ mol/L,点样量为0.5 μ L。所述的室温杂交液(Hyb)，包括3mL的20 X SSPE, 100 μ L的20% SDS和一定量的甲酰胺，并用水补足至20mL，其特征在于，甲酰胺的用量为3-6mL，其优选用量为5mL。3.—种如权利要求2所述的用于分型诊断口蹄疫病毒的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括聚合酶链式反应扩增和室温反向斑点杂交两个主要步骤，反向斑点杂交可在室温下完成。 所述的聚合酶链式反应扩增本文档来自技高网...
【技术保护点】
一套用于分型诊断口蹄疫病毒的引物及探针，其特征在于，所述引物针对各血清型口蹄疫病毒的保守片段设计，O型、AsiaI型、A型、C型四种口蹄疫病毒共用一条通用上游引物(SEQ?No.1)、SAT1型、SAT2型、SAT3型三种口蹄疫病毒共用一条通用上游引物(SEQNo.2)，O型、AsiaI型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型七种口蹄疫病毒共用一条通用下游引物(SEQ?No.3)，引物5’端均以生物素标记，其核苷酸序列为：所述探针针对各血清型口蹄疫病毒的型特异性片段设计，探针5’端均加有10个T尾，其核苷酸序列为：所述引物和探针可用于O型或者AsiaI型或者A型或者C型或者SAT1型或者SAT2型或者SAT3型的口蹄疫病毒或者其中的两种或者三种或者四种或者五种或者六种或者七种血清型口蹄疫病毒的聚合酶链式反应?反向斑点杂交分型诊断。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：邹明强，薛强，孙芳芳，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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