本发明专利技术属于植物分子生物学与转基因相关技术领域。具体为拟南芥热激转录因子基因AtHSFA6a抗高温功能的验证，以及该基因在抗高温植物新品种培育中的应用。本发明专利技术以模式植物拟南芥为材料，利用AtHSFA6a基因T-DNA插入纯合突变体株系salk_045608研究AtHSFA6a基因在植物抗高温方面的功能。实验结果显示：AtHSFA6a基因敲除突变体在热激胁迫下表现敏感表型，且在根长、地上部鲜重、电导率、渗透压、丙二醛含量和SOD酶活性等生理指标方面均与野生型有显著或极显著差异；说明AtHSFA6a基因在植物应答热激胁迫的信号转导途径中具有重要的作用，预计该基因的过量表达可提高植物的耐热性并在植物抗逆分子育种中具有较大经济价值。
【技术实现步骤摘要】
—种热激转录因子基因AtHSFA6a及其编码蛋白与应用
:本专利技术涉及植物分子生物学领域，具体为拟南芥热激转录因子(Heat ShockTranscription Factors, HSFs)家族成员AtHSFA6a抗高温新功能的验证，以及该基因在抗高温植物新品种培育中的应用。
技术介绍
:温度的变化对植物生长发育具有重要的影响，适宜的温度能够保证或促进植物正常的生长发育，而不适宜的温度条件则会抑制植物的生长，甚至使植物死亡。自二十世纪以来，随着世界人口的飞速增长及工业化程度的不断加深，温室效应越来越严重，全球温度的逐步升高已成为作物正常生长、发育和获得高产的一个重要限制因素。现代分子生物学和基因工程相关技术的日益成熟，使人们从分子水平上探知植物对高温胁迫的响应及高温诱导相关信号在植物体内的传导途径成为现实，并且为改良作物的抗高温性能开辟了新的途径，在了解植物响应高温的分子机制的基础上，充分利用植物自身的基因资源，发掘植物抗高温相关基因，对培育抗高温性能提高的作物具有重要的指导意义。拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科，芸薹属植物，它不仅是第一个被测定基因组序列的模式植物(Athanasios Theologis.et al., NATURE.2000, V0L408:816-820)，而且具有基因组规模较小、植株株型矮小、生长周期短、自花授粉而又易于杂交等优点。因此以拟南芥作为分子遗传学和基因工程研究的模式植物，从中鉴定和克隆与热胁迫相关的基因，并结合转基因操作技术是培育耐高温性能增强植物的一条有效途径。转录因子(Transcription factors, TFs)又称反式作用因子，是一类和专一性DNA序列特异结合并能激活或抑止相关基因转录的蛋白质分子。热激转录因子(Heatstress transcription factors, HSFs)是一类能够调控不同热激蛋白(Heat shockprotein, HSP)基因表达的专用转录因子。基因组研究发现拟南芥中包含21个HSF基因家族成员。以前的研究证明AtHSFA6a (晁旭，王亚平，巩振辉，梁燕，赵军.西北植物学报，2007，27 (7) =1305-1310)基因在拟南芥热胁迫信号应答链中起到重要作用，ant1-RNA抑制该基因使突变体株系在存活率等方面与野生型有较大差异。但从来没有关于该基因在热胁迫条件下对根部和地上部生长发育以及对植物生理生化影响的报道，从生理生化和分子遗传学角度深入分析该基因的功能或许可以为人们找到一条利用分子育种手段培育耐高温或其它逆境能力增强的作物新品种的有效途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一个拟南芥热激转录因子(HSF)基因，以及该基因在应答热激胁迫反应中的功能和在培育耐高温植物中的作用。所提供的HSF 基因为 AtHSFA6a (AT5G43840)。上述基因具有SEQ ID N0.1的碱基序列。上述基因编码的蛋白 质具有SEQ ID N0.2的氨基酸序列。AtHSFA6a 基因的 T-DNA 插入突变体 salk_045608 是从 ABRC (Arab1-dopsisBiological Resource Center)定购获得。通过PCR鉴定获得纯合插入突变体，通过RT-PCR在mRNA水平上鉴定基因的敲除情况。通过上述鉴定，获得AtHSFA6a基因T-DNA插入突变体salk_045608的纯合株系，并以之为材料进行热激处理，观察热胁迫表型并拍照。然后对热胁迫处理后的拟南芥幼苗进行耐高温相关指标的测定，包括:主根长度测量，地上部鲜重测量，相对电导率测定，渗透压测定，相关酶活性测定，丙二醛含量测定。【附图说明】:图1显示野生型和突变体PCR和RT-PCR检测的电泳结果，结果表明所获AtHSAF6a基因突变株系salk_045608为T-DNA纯合插入株系，其转录本被敲除。图2显示野生型和突变体热胁迫12天后的表型图片，结果表明突变体经热胁迫处理后生长受到抑制，表现热敏感表型。图3显示热胁迫后野生型和突变体根长和地上部鲜重差异，结果表明突变体根长和地上部鲜重极显著低于野生型(P = 0.01, P = 0.005)，表现为热敏感。图4显示热胁迫后野生型和突变体电导率差异，结果表明突变体电导率在缓苗24h左右显著高于野生型(P = 0.012)。图5显示热胁迫后野生型和突变体渗透压差异，结果表明热胁迫后突变体渗透压显著高于野生型(P = 0.022)。图6显示热胁迫前后野生型和突变体丙二醛(MDA)含量差异，结果表明热胁迫前突变体MDA含量显著低于野生型(P = 0.026)，而热胁迫后突变体MDA含量显著高于野生型(P = 0.011)。图7显示热胁迫前后野生型和突变体S0D活性差异，结果表明热胁迫前突变体S0D活性显著高于野生型(P = 0.044)，而热胁迫后突变体S0D活性显著低于野生型(P =0.016)。【具体实施方式】:下面结合实验方法和数据进一步阐述本专利技术。1.拟南芥幼苗培养:野生型和突变体种子分别用0.5%次氯酸钠溶液浸泡消毒lOmin，消毒后的种子放入4°C冰箱春化2天后点布于含1%琼脂的MS(Murashige and Skoog)固体培养基上，置于22°C光照培养箱中萌发生长。2.纯合突变体鉴定:DNA提取:所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司。取约0.5g拟南芥新鲜叶片，研磨成糊状，加 400 μ 1 SDS 提取液(0.5% SDS(ff/V) ；200mMTris-HCl, pH = 8.0 ；250mM NaCl ；25mM EDTA) ;12，OOOr/min离心3min ;取上清，加等体积异丙醇轻轻摇晃，静置30min ;13，000r/min离心5min ;弃上清，用lml95%酒精冲洗1_2次后，自然风干，加去离子水30μ 1，4°C保存备用。RNA提取:所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司。所用研钵、枪头、离心管等一应物品事先用1% DEPC水浸泡过夜后高温高压灭菌备用。取新鲜幼苗约lg左右，于液氮中研磨成粉状，加1ml TRIZOL提取液混匀，静置lOmin ;4°C下12，OOOr/min离心lOmin ;取上清加300 μ 1氯仿混匀，静置lOmin后4°C, 12, OOOr/min离心15min,样品分为3层，RNA位于上层水相中；取500μ 1上层水相转移到新离心管中，加等体积异丙醇沉淀 10-20min ; 12，OOOr/min 离心 lOmin,弃上清;用 75% 酒精洗漆 1-2 次,7，OOOr/min 离心2min,晾干lmin左右，加60 μ 1无RNase水，轻轻震荡使RNA溶解，置于_70°C冰箱保存备用。RT-PCR:所用反转录试剂盒(#kl621)购自 Fermentas。First strand cDNAsynthesis:管中加入 RNA1μ 1, oligo(dT) 18primerlμ 1, RNase-free waterlμ 1,65 °C处理5min后迅速冰浴冷却；然后再加5XReaction buffer4 μ 1, Ribolock?RNaseinhib本文档来自技高网...
【技术保护点】
拟南芥热激转录因子基因AtHSFA6a，其碱基序列如SEQ?ID?No.1。
【技术特征摘要】
1.拟南芥热激转录因子基因AtHSFA6a，其碱基序列如SEQID N0.1。2.权利要求1所述的热激转录因子基因AtHSFA6a编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID N0.2。3.权利要求1所述的热激转录因子基因AtHSFA6a突...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐江，徐小栋，东方阳，鲁黎明，王西瑶，张少斌，洪雪，麻艳超，迟志海，丁在松，付金东，赵明，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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