柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法技术

一种柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法，属于生物技术领域。本发明专利技术目的是利用免疫学原理，提供一种柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法。本发明专利技术包括如下步骤：采用甲醛灭活的方法制备病原菌颗粒性抗原；取a作为抗原，与弗氏完全佐剂等体积混合，免疫健康白兔；两周后取a与弗氏不完全佐剂等体积混合，对b中白兔采用同样方法进行二次免疫，采用间接ELISA法监测抗血清效价，并按每隔两周免疫一次的方式进行第三、四次免疫，第四次免疫两周后单独用颗粒性免疫原冲击免疫一次；收集白兔血液，分离抗血清；纯化抗血清，得到目标多克隆抗体，并鉴定其蛋白含量、效价及特异性；步骤a中的病原菌为柱状黄杆菌G4R3，为柱状黄杆菌的代表类群。本发明专利技术方法简单、成本低廉，具有特异性高，蛋白含量高、效价高的优点，可用于今后柱状黄杆菌的快速诊断及预防免疫。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种，属于生物
。本专利技术目的是利用免疫学原理，提供一种。本专利技术包括如下步骤：采用甲醛灭活的方法制备病原菌颗粒性抗原；取a作为抗原，与弗氏完全佐剂等体积混合，免疫健康白兔；两周后取a与弗氏不完全佐剂等体积混合，对b中白兔采用同样方法进行二次免疫，采用间接ELISA法监测抗血清效价，并按每隔两周免疫一次的方式进行第三、四次免疫，第四次免疫两周后单独用颗粒性免疫原冲击免疫一次；收集白兔血液，分离抗血清；纯化抗血清，得到目标多克隆抗体，并鉴定其蛋白含量、效价及特异性；步骤a中的病原菌为柱状黄杆菌G4R3，为柱状黄杆菌的代表类群。本专利技术方法简单、成本低廉，具有特异性高，蛋白含量高、效价高的优点，可用于今后柱状黄杆菌的快速诊断及预防免疫。【专利说明】
本专利技术属于生物
。
技术介绍
细菌性疾病是水生动物病害中最严重的一大类传染性疾病。据统计，我国每年因水生动物病害问题而造成的直接经济损失就达百亿元之巨，并且还有上升的趋势。对病原进行准确检测是疾病确诊和控制的前提。同时，水产品进入终端消费市场，对水产品是否含有病原微生物进行准确而又快速的检测是食品安全的重要保障。在动物性水产品出入境检疫上，对病原体进行有效检疫对保护本国安全、防止病原扩散传播具有极为重要的意义。传统的水生动物细菌性疾病的诊断，主要依靠对患病鱼体的临床症状、病理组织学检查等进行分析。但由于水生动物疾病常常存在不同的病原微生物会引起类似的症状，即使同一病原在不同动物或同一种动物中症状也不尽一致，因此，只依靠临床观察实现确诊困难重重。随后又发展了实验室特异性的诊断方法，如细菌选择性培养、生化鉴定、PCR法等。但这几种检测方法在准确性及检测速度上都有所限制，而且操作不便，需专业人才，一般只适应于实验室诊断或研究应用，而不适用于生产。而水生动物疾病往往呈爆发性，一旦延误，后果不堪设想。随着免疫学技术在生物医学及动植物病原菌检测上的广泛应用，将该技术应用于检测水生动物细菌性疾病已经成为可能。柱状黄杆菌(Flavobacterium columnaris)属于黄杆菌目，黄杆菌科，黄杆菌属，是一种世界范围的水生动物致病菌(Bernardet J F，Segers P, Vancanneyt M, etal.Cutting a Gordian knot: emended classification and description of thegenus Flavobacterium, emended description of the family Flavobacteriaceaej andproposal of Flavobacterium hydatis nom.nov.(basonym, Cytophaga aquatilisStrohl and Tait 1978) .1nt J Syst Bacteriolj 1996, 46(1): 128-148.)，该菌所致鱼类病害分布于包括我国在内的世界多个国家，如欧洲、加拿大、美国、日本等。其宿主范围极其广泛，可致鲑科、鲤科、亚口鱼科、叉尾科、棘臀鱼科等多种鱼类感染发病(Jack S W,Taylor P Wj Crosby M D， et al.Summary of bacterial isolates from farm-rearedchannel catfish (1979~1988) .Vet Diagn Invest, 1992，4: 193 ~195.)，其中最常见的就是鱼类烂鳃病(gill-rotdisease)，表现为鳃丝腐烂带污泥，严重时鳃丝软骨外露，鳃盖内表皮被腐蚀，形成一个透明“小窗”(俗称开天窗)，其传染迅速，病程长，一经发病难控制其蔓延(Ordal E Jj Rucker R R.Pathogenic myxobacteria.Proc SocExp Biol Med, 1944，56:15-18.)。全球每年由于感染柱状黄杆菌引起鱼类发病死亡所造成的经济损失极其严重。而几乎所有的淡水鱼类均对该菌敏感，自然和养殖条件下的海水鱼类以及观赏鱼类也可感染发病(Skrodenyte-arbaciauskiene V，KazlauskieneN， Jankauskiene R.Evaluation of quantitative composition of Flavobacteriumcolumnare at the Zeimena salmon hatchery.Acta Zool Lit, 2006， 16(4): 304~308.)o目前国内外尚缺乏对柱状黄杆菌的快速检测及预防措施，主要原因是受到需要特异性抗体的限制。因此，研制出高效价、高蛋白含量、特异性好的柱状黄杆菌多克隆抗体将为今后柱状黄杆菌的快速检测及病害防控提供重要的技术支持，并且对改善食品质量与安全，提高我国国民健康水平，起到不容忽视的作用。
技术实现思路
本专利技术目的是利用免疫学原理，提供一种。本专利技术包括如下步骤: a、采用甲醛灭活的方法制备病原菌颗粒性抗原； b、取a作为抗原，与弗氏完全佐剂等体积混合，免疫健康白兔； C、两周后取a与弗氏不完全佐剂等体积混合，对b中白兔采用同样方法进行二次免疫，采用间接ELISA法监测抗血清效价，并按每隔两周免疫一次的方式进行第三、四次免疫，第四次免疫两周后单独用颗粒性免疫原冲击免疫一次； d、收集白兔血液，分离抗血清； e、纯化抗血清，得到目标多克隆抗体，并鉴定其蛋白含量、效价及特异性； 步骤a中的病原菌为柱状黄杆菌G4K3，为柱状黄杆菌的代表类群。本专利技术步骤a中颗粒性抗原的制备方法为:取穿刺菌种接种至胰胨液体培养基中，27°C摇床活化24h ;将活化后的菌液做平板划线分离；单克隆菌落转接至100ml胰胨液体培养基中增菌；菌液用新鲜配制的液体培养基做适当梯度稀释，采用分光光度法法测定各稀释度菌液的OD6tltl值，结合平板菌落计数法计数菌液浓度，制备活菌数与OD6tltl值的标准曲线，根据标准曲线计算菌液浓度将扩增的菌液离心，并用无菌生理盐水洗脱，弃上清，反复2次，离心收集菌体；生理盐水重悬，并于重悬菌液加入0.5%的甲醛4°C灭活24h，制备柱状黄杆菌颗粒性抗原；24 h后将灭活菌液离心弃上清，沉淀用灭菌生理盐水洗涤3次，调整菌液浓度。本专利技术步骤a中用于培养柱状黄杆菌的培养基为胰胨培养基，培养条件为:27°C培养24-36h，其中胰胨培养基:0.5%。胰蛋白胨，0.2%。牛肉膏，0.5%。酵母浸粉，醋酸钠0.2%。，I moL/L NaOH 调 pH 至 7.2-7.4，高压灭菌 20min。本专利技术步骤b中，实验动物为2kg健康雄性新西兰白兔；免疫方法采用背部脊柱两侧皮下5点注射免疫，免疫剂量为0.5 X IO9Cfu/只。本专利技术步骤b和步骤c中，采用的是漩涡震荡乳化剂逐滴加入颗粒性抗原的方法:取灭菌的青霉素瓶，按需要量加入弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，盖好灭菌胶塞，用漩涡震荡器使之高速旋转，用灭菌注射器吸取与佐剂等体积的颗粒性细菌抗原逐滴加入佐剂中，可见抗原液滴入后在佐剂中呈球状并逐渐变小消失；抗原溶液全部加完后再涡本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柱状黄杆菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：a、采用甲醛灭活的方法制备病原菌颗粒性抗原；b、取a作为抗原，与弗氏完全佐剂等体积混合，免疫健康白兔；c、两周后取a与弗氏不完全佐剂等体积混合，对b中白兔采用同样方法进行二次免疫，采用间接ELISA法监测抗血清效价，并按每隔两周免疫一次的方式进行第三、四次免疫，第四次免疫两周后单独用颗粒性免疫原冲击免疫一次；d、收集白兔血液，分离抗血清；e、纯化抗血清，得到目标多克隆抗体，并鉴定其蛋白含量、效价及特异性；步骤a中的病原菌为柱状黄杆菌G4R3，为柱状黄杆菌的代表类群。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吕娜，张捷，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：