本发明专利技术公开了一种抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，通过基因工程菌在体外大量表达和纯化兔病毒性出血症病毒RHDV衣壳蛋白VP60抗原，将纯化的VP60抗原与适宜的佐剂制备成疫苗免疫产蛋鸡，并从鸡蛋中提取高效价抗RHDV的卵黄抗体，最后制备成可直接注射使用的抗体制剂。本发明专利技术建立的方法，是一种新的、安全、成本低、高效预防和治疗兔病毒性出血症的卵黄抗体制备方法，所制得的抗体用生理盐水溶解后，可直接通过耳缘静脉或皮下注射达到预防和治疗的作用，其紧急预防RHDV感染的作用达到100%，而早期治疗效率可达到95%。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，通过基因工程菌在体外大量表达和纯化兔病毒性出血症病毒RHDV衣壳蛋白VP60抗原，将纯化的VP60抗原与适宜的佐剂制备成疫苗免疫产蛋鸡，并从鸡蛋中提取高效价抗RHDV的卵黄抗体，最后制备成可直接注射使用的抗体制剂。本专利技术建立的方法，是一种新的、安全、成本低、高效预防和治疗兔病毒性出血症的卵黄抗体制备方法，所制得的抗体用生理盐水溶解后，可直接通过耳缘静脉或皮下注射达到预防和治疗的作用，其紧急预防RHDV感染的作用达到100%，而早期治疗效率可达到95%。【专利说明】一种抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法
本专利技术涉及一种抗兔病毒性出血症病毒卵黄抗体的制备，属于生物工程与畜病防治
。
技术介绍
兔病毒性出血症(俗称兔痕)是由兔病毒性出血症病毒(rabbit hemorrhagicdisease virus, RHDV)引起的兔的ー种烈性传染病,具有高度致死性、传染性特点。自1984年在中国首先发现以来，本病在世界范围内广泛流行，给养兔业带来巨大的经济损失和威胁，而且严重威胁濒临灭绝的野兔品种。目前该病尚无有效治疗药物，针对RHDV只能采取疫苗预防，疫苗接种7-10天后才能产生足够抗体，不能及时有效保护。由于RHDV目前无法在体外细胞系中得到病毒扩增，因此均采用将RHDV毒株感染家兔后，处死家免，取其被病毒感染的组织，灭活后制备成组织灭活疫苗，在整个这个过程中存在病毒散毒的危险，且不符合动物福利的要求。卵黄抗体(immunoglobulin yolk, IgY)技术简称IgY技术，即产蛋鸡经特定抗原免疫后，产生相应特异性抗体，并转运、储存于卵黄中，形成卵黄抗体。IgY是鸡蛋卵黄中的多克隆抗体，生物学特性除了具有其他动物源性IgG抗体的高度特异性、敏感性之外，其还具有更强的抗原亲和力、耐热、耐酸碱、制备成本低等突出优点。由于IgY生产成本低，产量高，特异性強，是ー种非常好的可以替代其它动物血清治疗的抗体药物，目前在人和动物被动免疫治疗和诊断方面表现出了良好的临床效果。关于IgY的作用机制，主要是通过与病原体细菌或病毒直接结合，抑制病原体的生长和繁殖，阻断其对人和动物正常细胞的粘附和感染作用。经对现有的专利、技术文献检索发现，张宏伟等人2007年在其中国农业科学院的硕士论文“抗兔病毒性出血症卵黄抗体的制备与应用”中，将兔病毒性出血症组织灭活疫苗免疫普通产蛋鸡；采用辛酸-硫酸氨二步盐析法-离子层析交换法，从卵黄液中提取高效价的兔病毒性出血症卵黄抗体，且其对攻毒兔的治疗率达100%。王治方等人在《中国养兔杂志》2007年第4期上发表的“抗兔瘟精制卵黄抗体的研制” 一文中，将兔病毒性出血症组织灭活疫苗免疫产蛋鸡；采用3.5%-4.0%的聚乙二醇6000和超滤的方法提取到兔病毒性出血症卵黄抗体，且其对攻毒兔的早期治疗率达80%。两论文中，由于RHDV目前无法在体外细胞系中得到病毒扩增，因此均采用各自分离的RHDV毒株，感染家兔后，处死家兔制备成组织灭活疫苗免疫产蛋鸡，但在整个这个过程中存在散毒的危险，且不符合动物福利的要求。采用辛酸-硫酸氨二步盐析法-离子层析交换法提取卵黄抗体，过程较为复杂，成本高；而采用聚乙二醇的方法，张小莺等在2011年出版的《卵黄抗体技木》书中，总结前人的研究结果表明，用PEG的方法提取卵黄抗体得率较水稀释和超滤法等低，在王治方等人的论文中未见其卵黄抗体的产率报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中存在的不足和缺陷，提供一种抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法。采用基因工程技术实现在体外大量表达兔RHDV的VP60抗原，将纯化的VP60抗原经适宜的佐剂乳化后免疫产蛋鸡，并从鸡蛋中提取和纯化出高滴度的抗兔RHDV卵黄抗体，最后经冷冻干燥制备成抗体干粉，于-20°C或-80°C。经无菌检验合格后，用生理盐水溶解该卵黄抗体干粉，适用于兔病毒性出血症RHDV的早期治疗和紧急预防使用，是一种新的安全、成本低、高效预防和治疗兔病毒性出血症的抗体制备方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下: 一种抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤: Cl)免疫原的制备:通过PCR扩增技术获得RHDV的结构蛋白VP60的N端250个氨基酸序列VP60-N，并实现其在基因工程菌中的表达，通过分离纯化获得VP60-N重组抗原； (2)免疫产蛋鸡及提取卵黄抗体:将纯化的VP60-N抗原蛋白经佐剂乳化免疫产蛋鸡，检测抗体的纯度、特异性及滴度后，大量提取纯化IgY卵黄抗体，冷冻干燥后将抗体干粉冻存； (3)制剂的制得:检测步骤(2)中得到的IgY卵黄抗体干粉，经无菌检验合格后，与生理盐水制备成安全的皮下或静脉注射用抗体制剂，或冷冻干燥形成干粉制剂后保存。所述的RHDV的结构蛋白VP60的N端250个氨基酸序列VP60-N如下:SEQ ID N0.1: GKARAAPQGE AAGTATTASV P GTTTDGMDP GVVATTSVIT AENSSASIATAGIGGPPQQV DQQETffRTNF Y YNDVFTffSV ADAPGSILYT VQHSPQNNPF TAVLSQMYAG WAGGMQFRFIVAGSGVFGGR LVRAVIPPGI EIGPGLEVRQ FPHVVIDARS LEPVTITMPD LRPNMYHPTG DPGLVPTLVLSVYNNLINPF GGSTSAIQVT VETRPSEDFE FVMIRAPSSK TVDSISPAGL LTTPVLTGVG。所述PCR扩增的引物为:上游引物:5’ - CCQGAATTCEcoR I ATGGAGGGCAAAGCCCGCA-3’，下游引物:5’ - CCQCTCGAGXho I ATTGCCAACACCAGTGA-3’ ； PCR退火温度为52-55°C。步骤(1)中免疫原的制备具体为:分析和选择兔RHDV病毒VP60的主要抗原表位决定簇肽段，即N端l-250aa肽段(VP60-N)作为免疫原；采用PCR的方法，以VP60全长基因序列为模板扩增VP60-N片段；通过基因工程技术，将该片段克隆到原核表达载体pET28a(+)上，转化基因工程菌BL2UDE3)，完成VP60-N重组抗原蛋白的原核诱导表达；最后纯化重组的VP60-N抗原蛋白。PCR扩增后的产物，经及/和沿ο /酶切回收后，与同样经过双酶切处理的pET28a(+)原核表达载体进行连接和转化，形成重组质粒pET28a-VP60-N ;将重组质粒pET28a-VP60-N转化疋coli BL21 (DE3)，次日挑取单菌落接种于3 ml含卡那霉素的LB液体培养基，于37°C，150 rpm振荡培养；过夜培养后，按1:200接种扩大培养，待菌液OD 600值为0.6-0.8时加入终浓度为0.5 mM IPTG诱导，温度为22°C -30°C ;诱导8-12 h后，12000rpm离心收集菌体，加入终浓度为10 mg/ml的溶菌酶，冰浴lh，采用4次反复冻融法裂解菌体，12000 rpm离心15 min，收集上清，S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法,?其特征在于包括以下步骤：（1）?免疫原的制备：通过PCR扩增技术获得RHDV的结构蛋白VP60的N端250个氨基酸序列VP60?N，并实现其在基因工程菌中的表达，通过分离纯化获得VP60?N重组抗原；（2）免疫产蛋鸡及提取卵黄抗体：将纯化的VP60?N抗原蛋白经佐剂乳化免疫产蛋鸡，检测抗体的纯度、特异性及滴度后，大量提取纯化IgY卵黄抗体，冷冻干燥后将抗体干粉冻存；（3）制剂的制得：检测步骤（2）中得到的IgY卵黄抗体干粉，经无菌检验合格后，与生理盐水制备成安全的皮下或静脉注射用抗体制剂，或冷冻干燥形成干粉制剂后保存。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张智，李再新，谢万如，胡卫东，李天有，邹晓阳，李丙超，陆仕海，
申请(专利权)人：四川理工学院，
类型：发明
国别省市：
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