本发明专利技术涉及一种用于检测人KRAS基因突变的试剂盒及其检测方法，包括2对扩增引物和2条测序引物，本发明专利技术公开的检测KRAS基因突变的试剂盒完全基于一种新的实验方法设计，结构设计简单合理、使用方便；在检测KRAS基因突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种用于检测人KRAS基因突变的试剂盒及其检测方法，包括2对扩增引物和2条测序引物，本专利技术公开的检测KRAS基因突变的试剂盒完全基于一种新的实验方法设计，结构设计简单合理、使用方便；在检测KRAS基因突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点。【专利说明】—种用于检测人KRAS基因突变的试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及一种用于检测人KRAS基因突变的试剂盒及其检测方法，属于分子生物学领域。
技术介绍
1)KRAS基因突变在结直肠癌中的临床意义近年来，随着人民生活水平的不断提高，饮食习惯和饮食结构的改变以及人口老龄化，我国结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的发病率和死亡率均保持上升趋势。其中，结肠癌的发病率上升尤为显著。大多数患者发现时已属于中晚期。结直肠癌发病率22.1万，死亡率11万，5年生存率63.7%。KRAS是EGFR (表皮生长因子受体)信号传导通路中的一个关键的下游调节因子，参与细胞生长的调节，在癌变发生过程中起着重要作用。KRAS基因产物参与了控制基因转录的激酶信号传导路径，从而能调节细胞的生长与分化。KRAS基因的改变使KRAS蛋白发生变化，其结果KRAS蛋白不再具有裂解GTP分子和释放GTP分子的能力。这样的改变导致这条信号传导路径始终处于“开”通的状态。这种“开”的信号导致细胞的生长和增生。因此KRAS的过度表达与扩增导致持续的细胞增殖，这是肿瘤发生的关键一步。西妥昔单抗和帕尼单抗是作用于EGFR的单克隆抗体，可以抑制下游的信号通路传导。2008年6月，美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上CRYSTAL、OPUS等研究了西妥昔单抗联合F0LFIRI和FOLFOX作为转移性结直肠癌的初始治疗作用，结论为:KRAS野生型患者在加用西妥昔单抗治疗后PFS得到了显著改善。若KRAS有突变，则无论单药或联合均不应使用西妥昔单抗或帕尼单抗，因为不仅无效，还增加副反应，浪费金钱。2008年10月，KRAS基因检测被写入《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》，专家组强烈推荐所有转移性结直肠癌患者均应进行KRAS基因型检测，原发灶或继发灶组织均可，对于KRAS野生型的患者可考虑进一步检测BRAF分型。2010年版中国《结直肠癌诊疗规范》指出:完整的病理报告内容应该包括K-ras基因状态的检测，同时晚期/转移性结直肠癌靶向药物治疗前应检测KRAS。2) KRAS基因突变在非小细胞肺癌NSCLC的临床意义原发性肺癌(以下简称肺癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一。2012年WHO统计显示，肺癌是我国目前发病率和死亡率第I位的恶性肿瘤。基于肺癌的生物学特性、治疗和预后，WHO将其分为两大类:非小细胞肺癌NSCLC和小细胞肺癌SCLC。其中NSCLC占肺癌的85%以上。虽然治疗肺癌技术有了很大的提高，但5年生存率没有明显改善，而且大多数肺癌患者死于无法控制的远处转移，传统的化疗和放疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的副作用。因此，选择肺癌细胞特异的分子靶点，应用针对该靶点的药物进行治疗，在取得明显疗效的同时又避免对正常细胞的伤害的治疗模式，已经被肿瘤学术界和广大患者所认同和采用。EGFR (epidermal growth factor receptor,表皮生长因子受体)是目前用于NSCLC分子靶向治疗的最主要靶点。EGFR受体抑制剂TKI小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor),通过阻断细胞受体的ATP结合位点，阻止下游信号传递而产生抑制肿瘤作用。三种EGFR-TKI (吉非替尼/易瑞沙，厄罗替尼/特罗凯，和凯美钠)是目前用于NSCLC分子靶向治疗的主要药物，但在不同的病人中EGFR-TKI的疗效差异很大。大量临床实验发现，除了 EGFR突变，KRAS突变能帮助NSCLC病人更好的预测吉非替尼疗效；KRAS突变的NSCLC病人用厄洛替尼联合处理后临床预后较差。2012年《美国国立癌症综合网络(NCCN)非小细胞肺癌临床实践指南》病理评估原则中明确=KRAS突变和内源性TKI耐药有关，确定KRAS基因状态有助于选择适合TKI治疗的病人。同时指出，KRAS基因状态是NSCLC生存的预后指标，也是EGFR-TKI药物的疗效预测指标。
技术实现思路
KRAS基因最常见的突变位点见于12、13、61密码子，这些突变可发生在许多人类肿瘤中。本专利技术解决上述技术问题提供一种用于检测人KRAS基因突变的试剂盒及其检测方法，本专利技术采用基于实时序列检测的焦磷酸测序(Pyro Mark KRAS v2.0)技术对上述突变进行检测和定量，本试剂盒在检测KRAS基因突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点。本试剂盒包含2套PCR引物。一套能够扩增KARS基因外显子I，包含12、13密码子在内的片段，另一套能够扩增KARS基因外显子2，包含61密码子在内的片段。每套PCR引物中均有一条引物标记了生物素的引物，它能保证在测序反应中正确分离出待测DNA链。同时，该试剂盒还含有2条不同的测序引物，一条用于12、13密码子，另一条用于61密码子，它们用于后续的焦磷酸序列分 析中检测最常见的3个密码子突变(正常样品的分析序列如图1、2所示)。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下:一种用于检测人KRAS基因突变的试剂盒，包括如下扩增引物和测序引物:I)扩增引物:KARS 密码子 12、13F:5' -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3' (SEQ ID N0.1)；KARS 密码 12、13R: 5' -GTTGGATCATATTCGTCCACAAA-3' (SEQ ID N0.2)，5'端生物素标记；KARS 密码 61F:5' -CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCAGGATT-3' (SEQ ID N0.3)；KARS 密码 6IR: 5' -AAGAAAGCCCTCCCCAGTCC-3' (SEQ ID N0.4)，5'端生物素标记；2)测序引物:KARS 密码子 12、13:5' -TTGGATATTCTCGACACAGCAGGT-3' (SEQ ID N0.5)，检测密码子12和13 ；KARS 密码 61:5' -AAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3' (SEQ ID N0.6),检测密码子 61。其中，F:正向引物，R:反向引物。试剂盒中的其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。本专利技术还提供了一种应用上述的试剂盒检测人KRAS基因突变的方法，包括:I)提取样本DNA (使用天根公司基因组DNA提取试剂盒，货号DP331)；2) PCR 扩增:配制50 μ I PCR 反应体系，包含:ddH2021 μ 1、2XTaq mix25 μ I (novoprotein 公司，产品货号:E005)、样本DNA2y 1、浓度为10 μ M的EGFR基因一对引物混合物2 μ 1，按照下面的循环参数设置循环仪:95°C5min预变性；然后依次在95°C 30s,61°C 30s,72°C 30s，35个循环；再在72°C保持IOmin,最终保持在4°C，得到扩增产物；其中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测人KRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，包括如下扩增引物和测序引物：1）扩增引物：KARS密码子12、13F:5′?AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT?3′；KARS密码子12、13R:5′?GTTGGATCATATTCGTCCACAAA?3′，5′端生物素标记;KARS密码子61F:5′?CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCAGGATT?3′；KARS密码子61R:5′?AAGAAAGCCCTCCCCAGTCC?3′，5′端生物素标记;2）测序引物：KARS密码子12、13：5′?TTGGATATTCTCGACACAGCAGGT?3′；KARS密码子61：5′?AAACTTGTGGTAGTTGGAGC?3′。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王彤，陈大方，
申请(专利权)人：瑞希基因科技北京股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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