本发明专利技术属于水产生物技术领域，一种抑食金球藻Aureococcus?anophagefferens的快速检测方法。利用抑食金球藻的特异性的引物和探针通过荧光定量PCR扩增及其荧光信号对海水中的抑食金球藻进行检测。本发明专利技术检测方法包括藻基因组DNA提取、荧光定量PCR检测。其优点是快速、特异性强、藻密度检测范围宽。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于水产生物
，一种抑食金球藻Aureococcus?anophagefferens的快速检测方法。利用抑食金球藻的特异性的引物和探针通过荧光定量PCR扩增及其荧光信号对海水中的抑食金球藻进行检测。本专利技术检测方法包括藻基因组DNA提取、荧光定量PCR检测。其优点是快速、特异性强、藻密度检测范围宽。【专利说明】
本专利技术属于水产生物
，一种抑食金球藻Aureococcus anophagefferens的快速检测方法。
技术介绍
抑食金球藻Aureococcus anophagefferens是一种可以引发褐潮的微微型藻类，抑食金球藻褐潮暴发时海水变成黄褐色，并严重影响贝类的摄食活动，是一种对贝类养殖业具有破坏性影响的微微型藻。以往抑食金球藻主要在美国和南非等地发现，近年来我国北方海域时已有发现。抑食金球藻直径约2-3 μ m，形态上不易与其他微微型藻区分，因而常规显微观察的方法不适用于抑食金球藻的定量观测。Popels等根据该藻18S的基因片段建立一套Taqman探针荧光定量检测的方 法，该方法虽然灵敏简便，适用于大量样品的检测，但也具有若干不适用野外观测的特性。比如在不同野外环境生长的抑食金球藻，其18S的拷贝数不同，可能存在18S拷贝数与真实藻密度不对应的问题；同时该方法的可信检测上线为104cellS/mL，然而褐潮暴发是藻密度经常到达106cells/mL，因此该方法不利于高密度样品的直接检测。因此需要建立一种更加特异、稳定且适用于高密度褐潮藻华监控的技术手段。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种检测速度快、特异性高、灵敏稳定的快速检测抑食金球藻的快速检测方法。，利用抑食金球藻的特异性的引物和探针通过荧光定量PCR扩增和荧光信号对海水中的抑食金球藻进行检测；其中，特异性的引物和探针分别为:上游引物7365F5 ‘-GCGGAGGTCGTGGAGAGG-3’，下游引物7366R5 ‘-GGGTGCGTCCGTAGACTTGA-3’，探针:5‘-CTCGGCTTCACGGGCGGCTTCC-3’。进一步的说，以海水样品中藻基因组总DNA为模版，利用抑食金球藻的特异性的引物和探针通过荧光定量PCR扩增和荧光信号对海水中的抑食金球藻进行检测。所述荧光定量PCR体系为:反应总体积为10 μ L，包括基因组DNA1-4 μ L，2X Premix Ex Taq Buffer Mix (Takara, Takara 商业化产品)5 μ L,探针 0.4μ?(浓度ΙΟμΜ),引物各0.2yL (浓度10 μ Μ),最后加灭菌去离子水至10 μ L。所述荧光定量PCR条件为95°C预变性30s ;95°C变性5s，60°C退火/延伸30s，收集Texas Red突光,40个循环。本专利技术所具有的优点:本专利技术检测方法采用脲基甲酸酯水解酶(allophanatehydrolase)为目标基因，其是抑食金球藻基因组中具有较高特异性的单拷贝基因。以该基因的序列设计特异性引物和Taqman探针，采用荧光定量PCR的技术手段进行检测具有快速、特异性强、灵敏、检测范围宽等优点。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术实施例提供的扩增结果图示图。图2为本专利技术实施例提供的目标基因的比对情况图。图3为本专利技术实施例提供的检测方法的标准曲线。【具体实施方式】实施例1首先在采样点采取IL海水样品，迅速通过80 μ m的纱絹过滤，样品避光保存待用。每个采样点的海水取出三份，每份准确定量200ml (褐潮暴发期IOOml )，分别通过5 μ m，和0.45 μ m的滤膜 ，抽滤压力不能大于0.02MPa。0.45 μ m的滤膜_20°C冷冻保存，直至下步操作。按照Takara基因组提取试剂盒的造作说明提取总DNA。然后进行荧光定量PCR反应，反应体系为:基因组DNA模版1-4 μ L，2 X Premix ExTaq Buffer Mix5 μ L,探针 0.4 μ L (浓度 10 μ Μ)，引物各 0.2 μ L (浓度 10 μ Μ)，最后加灭菌去离子水至IOyL ;荧光定量PCR仪器的程序参数为:95°C预变性30s ;95°C变性5s，60°C退火/延伸30s,收集Texas Red突光,40个循环。其中特异性的引物和探针为:上游引物7365F5 ‘-GCGGAGGTCGTGGAGAGG-3’，下游引物7366R5 ‘-GGGTGCGTCCGTAGACTTGA-3’，探针:5‘-CTCGGCTTCACGGGCGGCTTCC-3’。通过上述PCR扩增结果以及荧光信号对样品海水中的抑食金球藻进行检测；其中上述荧光定量PCR反应结果呈典型的PCR扩增曲线(参见图1 )。采用本专利技术的方法无需后处理，不用电泳、拍照，检测过程可在I小时左右结束，大大缩短反应时间。同时本专利技术方法检测的目标基因为单拷贝功能基因，经GenBank数据库比对，基因同源性相对较低(参见图2)，不存在非特异性扩增的可能，保证PCR反应的准确可靠。将上述样品经荧光定量PCR反应后得出的Ct值，可通过标准曲线(参见图3)换算藻样品的实际含量，进而可确定本专利技术的方法检测范围为5-106cellS/mL，检测灵敏，检测范围宽，可完全满足野外调查的需要。【权利要求】1.，其特征在于:利用抑食金球藻的特异性的引物和探针通过荧光定量PCR扩增及其荧光信号对海水中的抑食金球藻进行检测； 其中，特异性的引物和探针分别为:上游弓 I 物 7365F5 ‘ -GCGGAGGTCGTGGAGAGG-3 ’， 下游引物 7366R5 ‘-GGGTGCGTCCGTAGACTTGA-3’， 探针:5 ‘-CTCGGCTTCACGGGCGGCTTCC-3’。2.按权利要求1所述的抑食金球藻的快速检测方法，其特征在于:以海水样品中藻基因组总DNA为模版，利用抑食金球藻的特异性的引物和探针通过荧光定量PCR扩增和荧光信号对海水中的抑食金球藻进行检测。3.按权利要求1或2所述的抑食金球藻的快速检测方法，其特征在于:所述荧光定量PCR体系为:反应总体积为10μ L，包括基因组DNAl-4y L，2XPremix Ex Taq Buffer Mix(Takara，Takara商业化产品，无中文)5μ L，探针0.4yL(浓度10 μ Μ)，引物各0.2 μ L (浓度10 μ Μ),最后加灭菌去离子水至10 μ L04.按权利要求1或2所述的抑食金球藻的快速检测方法，其特征在于:所述荧光定量PCR条件为95°C预变性30s ;95°C变性5s，60°C退火/延伸30s，收集Texas Red荧光，40个循环。【文档编号】C12R1/89GK103468803SQ201310409553【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日【专利技术者】宋林生, 邱丽梅, 刘瑞, 张清春, 张峘 申请人:中国科学院海洋研究所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抑食金球藻的快速检测方法，其特征在于：利用抑食金球藻的特异性的引物和探针通过荧光定量PCR扩增及其荧光信号对海水中的抑食金球藻进行检测；其中，特异性的引物和探针分别为：上游引物7365F5‘?GCGGAGGTCGTGGAGAGG?3’，下游引物7366R5‘?GGGTGCGTCCGTAGACTTGA?3’，探针：5‘?CTCGGCTTCACGGGCGGCTTCC?3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋林生，邱丽梅，刘瑞，张清春，张峘，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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