MLDH-Fluorescein插层组装型荧光探针制造技术

本发明专利技术涉及一种MLDH-Fluorescein插层组装型荧光探针，其特征是：以磁性层状复合氢氧化物MLDH为载体，以荧光素为插层客体、通过低温离子交换反应制备而成。本发明专利技术所合成的MLDH-Fluorescein探针具有超顺磁性、明亮的荧光信号及较高的热稳定性，细胞传输的核靶向性强，能迅速渗透细胞膜、穿越细胞质将荧光物质送达细胞核并富集至核仁，可作为研究MLDH系统的细胞转运机制、评价核靶向传输效率的荧光探针。本发明专利技术适用于荧光素、荧光黄标记药物或生物分子靶向转运系统的构建，具有荧光信号明亮、贮存稳定性高、多功能集成、操作简易、成本低廉等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医用功能材料范畴，与药物及生物分子的靶向传输及示踪技术有关，具体涉及一种MLDH-Fluorescein插层组装型荧光探针。
技术介绍
在生物医学领域，层状复合氢氧化物（Layered double hydroxides，LDH）可用于运载一些生物分子及特效药物，具有优异的细胞传输与控制释放性能。异硫氰酸荧光素（Flourescein iso-thiocyanate，FITC）通过侧基与含胺和巯基的生物分子经亲核反应发生价键链接，作为荧光染料广泛应用于蛋白及抗体标记，伴随LDH在生物医学领域应用研究的深入，人们已针对FITC对镁、锌、铝基LDH的荧光标记作了大量工作。FITC-LDH的探针功能以正电性水镁石层板对FITC的插层、运载及释放为基础，但未跟LDH层板完全结合的游离态FITC分子可能在亲核环境发生异硫氰酸酯聚合，导致假阳性结果；特别是FITC自身的荧光稳定性差、猝灭较快，因此，作为一种流行的免疫荧光标记物，在研究LDH系统的细胞转运机制时，FITC并非理想的标记试剂。荧光黄( Fluorescein，C20H12O5，FLU）的碱式结构具有刚性共轭平面、荧光性质强，在反射光中呈黄绿色荧光、透视光中呈红橙色荧光，能在碱性条件下稳定存在、不易猝灭、并具有较高的负电性，非常适宜与LDH插层组装。有人曾研究过荧光黄阴离子对ZnAlLDH的插层效果及荧光性能，但有关磁性层状复合氢氧化物（Magnetic layered double hydroxides，MLDH）运载系统的荧光标记，尚无文献报道。专利技术内容本专利技术的目的在于提供一种MLDH-Fluorescein插层组装型荧光探针。本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种MLDH-Fluorescein插层组装型荧光探针，其特征是：以磁性层状复合氢氧化物MLDH为载体，以荧光素为插层客体、通过低温离子交换反应制备而成。所述载体磁性层状复合氢氧化物MLDH的组成符合化学式[FeII3FeIII(OH)8][Cl??2.0H2O]。所述磁性层状复合氢氧化物MLDH的获得过程为：在N2或Ar保护、0～60℃恒温及300 r??min-1磁搅拌条件下，按摩尔比Fe2+/Fe3+ = 2 ：1配制FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O溶液，以一元强碱溶液作沉淀剂进行共沉淀反应，反应完成后经过浆料原位晶化、固相析出和沉降、离心分离获得磁性层状复合氢氧化物MLDH。所述一元强碱的浓度为1~2 mol??L-1。所述共沉淀反应的反应终点以pH达到6.0~8.0为准。所述浆料原位晶化是在N2或Ar保护、0～60℃恒温及300 r??min-1磁搅拌条件下进行，晶化时间30~50 min。所述固相析出和沉降是在-80 ~ -20℃的冷乙醇中完成。所述低温离子交换反应的工艺步骤为：在-4℃～10℃恒温、N2或Ar保护及磁搅拌状态下，将磁性层状复合氢氧化物MLDH加水溶解，然后再加入荧光黄溶液，反应30~100 min，之后离心分离即可。所述荧光黄的用量按MLDH/荧光黄摩尔比1 : 1~2 : 1的比例称取，配制成pH 6.5 ~ 8.0的水溶液。 利用荧光信号对生物转运过程进行实时跟踪是纳米生物技术发展的重要方向，对了解生物转运的细胞机制、体内传输效果及相关的理论规律，建立高效转运系统、开发有商用价值的生物产品有重要意义。本专利技术以平面尺寸大、纵向尺寸窄、粒子径厚差别悬殊的弱碱性MLDH作为插层客体及标记荧光素的转运平台，具备有利于细胞跨膜转运、内化吸收的特殊优势；以荧光黄作标记试剂，通过荧光黄平面分子对LDH层板的几何与电性匹配，使MLDH运载系统的结晶度升高、热稳定性、光学稳定性及抗氧化性能增强。本专利技术所合成的MLDH-Fluorescein探针具有超顺磁性、明亮的荧光信号及较高的热稳定性，细胞传输的核靶向性强，能迅速渗透细胞膜、穿越细胞质将荧光物质送达细胞核并富集至核仁，可作为研究MLDH系统的细胞转运机制、评价核靶向传输效率的荧光探针。本专利技术适用于荧光素、荧光黄标记药物或生物分子靶向转运系统的构建，具有荧光信号明亮、贮存稳定性高、多功能集成、操作简易、成本低廉等优点。附图说明图1  MLDH载体及荧光探针MLDH-FLU的XRD衍射模型；图2  MLDH载体及MLDH-FLU荧光探针的IR光谱；图3  MLDH-FLU荧光探针的热分析曲线；图4  MLDH-FLU荧光探针的透射电镜图片；图5  用MLDH-FLU作探针干预SW480细胞的激光共聚焦荧光显微图像（a- 细胞核DAPI染色，b-MLDH-FLU染色，c- Cy5染色，d-三通道合成图像）。具体实施方式本专利技术化学合成所用试剂均为常规商品试剂，生物实验所用材料均为商业产品。以下实施例旨在进一步说明本专利技术，而不用于限制专利技术要求保护的范围。本专利技术所述的MLDH-Fluorescein探针系统，可通过以下技术方案实现：实施例1  用离子交换法合成MLDH-Fluorescein荧光复合物，并对产物作物相表征分析。具体操作过程如下：在0～60℃（优选40℃）恒温、N2或Ar保护及300 r??min-1磁搅拌条件下，用300 mL双蒸水溶解61.63 g FeCl2??4H2O，41.91 g FeCl3??6H2O，然后正向滴加500 mL 2 mol??L-1 NaOH溶液，控制共沉淀终点pH至6.0～8.0（优选6.50）。所得浆料在上述相同条件下原位晶化30 ~ 45 min后，关闭加热、磁搅拌系统，降低水浴温度。用-80℃～-20℃无水乙醇行溶剂转换，待固相沉降后，在N2保护、-10℃恒温及5000 r??min-1转速条件下离心10 min，得到组成为[FeII2FeIII(OH)6][Cl??H2O]的MLDH载体。在N2保护合成反应器中，加100 mL二次蒸馏水，打开N2阀排除系统中的空气，并通过食盐、冰、水及加热系统设置-4℃～10℃恒温条件（本例优选0℃）。取0.05 mol MLDH加入反应器，磁搅拌分散均匀。按MLDH/荧光黄摩尔比1 : 1~2 : 1的比例称取荧光黄4.2~8.3 g，以0.5 mol??L-1 NaOH溶解配成pH 7.0的溶液，加水稀释至135 mL。通过加料口将荧光黄溶液加入反应器中，反应30 ~100 min后，取出浆料在-10℃，5000 r??min-1离心15 min，所得固相在室温及充N2条件下加水搅拌、洗涤、离心6次，得到纯净的MLDH-FLU固相产品；最后，在0.075Mpa、65℃条件下真空干燥48 h。用日本理学Rigaku D/max-rB型X射线粉末衍射仪( Cu Kα , λ = 0.1542 nm ) 表征XRD，扫描速率2 (°)??min-1，扫描范围5°~ 80°；德国布鲁克公司TENEOR27型红外分光光谱仪，KBr压片，4000 ~ 400 cm-1；法国SET本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种MLDH?Fluorescein插层组装型荧光探针，其特征是：以磁性层状复合氢氧化物MLDH为载体，以荧光素为插层客体、通过低温离子交换反应制备而成。

【技术特征摘要】
1.一种MLDH-Fluorescein插层组装型荧光探针，其特征是：以磁性层状复合氢氧化物MLDH为载体，以荧光素为插层客体、通过低温离子交换反应制备而成。
2.按照权利要求1所述的MLDH-Fluorescein插层组装型荧光探针，其特征在于所述载体磁性层状复合氢氧化物MLDH的组成符合化学式[FeII3FeIII(OH)8][Cl??2.0H2O]。
3.按照权利要求1或2所述的MLDH-Fluorescein插层组装型荧光探针，其特征在于所述磁性层状复合氢氧化物MLDH的获得过程为：
在N2或Ar保护、0～60℃恒温及300 r??min-1磁搅拌条件下，按摩尔比Fe2+/Fe3+ = 2 ：1配制FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O溶液，以一元强碱溶液作沉淀剂进行共沉淀反应，反应完成后经过浆料原位晶化、固相析出和沉降、离心分离获得磁性层状复合氢氧化物MLDH。
所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：苟国敬，孙岳，张逢源，闫乾顺，曹菊琴，许红平，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：