本发明专利技术涉及应用于原核生物和真核生物的基于核酸探针的诊断检验。具体地，本发明专利技术描述了能够作为核酸探针检验的靶点区来检测并鉴别原核生物和/或真核生物的ssrA基因或tmRNA即ssrA基因的RNA转录序列，或其片段。不同生物的tmRNA序列的核酸排列对比可用于鉴别序列内的同源区和非同源区，这些区域又可以用来设计属特异性和种特异性的寡聚核苷酸探针。这些新鉴定的同源和非同源区提供了在分子水平鉴别和检测生物体的基础。以此方式鉴别出的这种寡核苷酸探针可用于检测样品中的tmRNA，由此能够指示不同样品类型中存在的非病毒生物的生存能力。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于原核生物和/或真核生物的检测和鉴定的核酸检验中靶序列的鉴定。
技术介绍
ssrA基因编码小而稳定的高拷贝数的转录RNA序列(tmRNA)，该基因在所有的细菌中都存在，并且近来证实这种基因还存在于叶绿体和硅藻体中。tmRNA具有tRNA和mRNA分子的双重功能，并且参与补救失去终止密码子的截短的mRNA，促进截短的多肽在蛋白酶进行降解之前完成通读翻译(Keiler, K. C. et al. (1996), Science, 271，990-993XtmRNA 的这种特殊功能使得研究者开始对其分子的二级结构与功能之间的关系进行分析。这些研究集中在来自不同微生 物的tmRNA的二级结构的保守性以及这种结构保守性在进化上的意义和功能相关性。Matveeva 等(Matveeva. 0 et al (1998), Vol. 16，No. 13，1374—1375)用tmRNA作为含有二级结构的RNA的模型研究了寡核苷酸与RNA分子的结合。研究没有实现鉴定tmRNA上的位点以及设计用于治疗目的的反义寡核苷酸的目标。现在用于细菌诊断的核酸靶点/探针的数量非常有限。因此，当前需要优先考虑鉴定出用于诊断目的的DNA和RNA靶点。用于发展探针的靶核苷酸序列例如可以是质粒，核糖体RNA基因，基因之间的序列，编码毒力因子的基因或随机基因组DNA片段。此外许多RNA分子已被人描述为可以作为基于RNA的检测的靶点如核糖体RNA和RNA酶P。任何基于核酸探针的检验都需要对当前所研究的真核生物和原核生物的核酸序列的特征有清楚的了解。对原核生物或真核生物进行可靠的检测，所用核酸探针应该为高度特异性(即，和其它生物的核酸序列没有交叉反应)和高度敏感性(即，该生物的所有或多数株系都应该与探针反应并被检测到)。所以，优选的靶点序列应存在于目标生物体的所有的株系之中。该序列应具有显著的序列变异性以保证将目标物种与其它亲缘相近的物种能够区分开；但另一方面，应具有足够的序列保守性以保证能够检测出目标物种的所有株系。一般来说，对一个核酸序列的精确鉴定是进行核酸探针检验的基础，但精确鉴定是费时、困难和不确定的。到目前为止只有为数不多的几种方法能够用于发展核酸探针来进行较广范围的微生物检测。已经被证实可以作为开发探针中潜在可用的靶点的核酸序列包括如rRNA基因和RNA以及rRNA 16S/23S基因间序列。多数核酸探针/靶点检验都集中于用细菌的高拷贝核糖体RNA (rRNA)和rRNA16S/23S间隔区序列(欧洲专利No. 0395 292)来进行检测和鉴定。市场上已经有的很多成功的商品化细菌检测试剂盒是基于rRNA探针/靶点来检测多种微生物。这包括由GenprobeInc. (SanDiego California)出售的基于16S rRNA的一系列商品化探针诊断试剂盒，以及由Innogenetics N. V. (Ghent, Belgium)出售的基于16S/23S间隔区序列的DNA探针。但是大多数这种诊断试剂盒都有其局限性，包括由于靶点序列的低拷贝数造成的敏感性缺乏以及很多情况下由亲缘相近的生物体之间的序列一致性引起的特异性缺乏。能够直接应用于样品中指示其中存在的任何活的微生物的基于核酸的检测方法在食品、工业、环境和医学中的应用都有重大意义。基于DNA的检测方法的一个缺点是他们不能区分活的和死的生物体。一些研究致力于用 rRNA 和 mRNA 作为细胞存活的指不剂(Sheridan, G. E. C. et al. (1998)Applied andEnvironmental Microbiology, 64, 1313-1318)。但是这些序列并不是合适的祀点，因为rRNA和mRNA在细菌死后在其细胞中还会存在48小时。随着基于核酸的类似微阵列形式的能同时对多核酸靶点进行监测的技术的出现，现在需要鉴别和表征新核酸序列作为探针和/或靶点区域来检测和鉴别活的真核细胞和原核细胞。专利技术公开本专利技术提供SSrA基因或其片段作为对原核生物或真核生物的核酸探针检验中的靶点区域。因此，本专利技术适用于除病毒外的所有生物体。尚没有有关使用ssrA基因的区域作为靶点区来检测和鉴别原核生物和真核生物的其它核酸探针检验及其相应的优势的报道。根据本专利技术的一个实施方案，ssrA基因分子中与从DNA分子5’末端起的高同源性区相对应的片段能够作为通用靶点区域。在本专利技术的另一个实施方案中，ssrA基因分子中与从DNA分子3’末端起的高同源性区相对应的片段能够作为通用靶点区域。在本专利技术的一个进一步的实施方案中，ssrA基因分子中与低同源性区域相对应的片段能够作为区分不同物种的核酸探针检验的靶点区。在本专利技术的另一个进一步的实施方案中，ssrA基因分子中与低同源性区域相对应的片段能够作为用来产生物属特异性探针的靶点区。如下文所描述，不同生物体的ssrA基因的核酸序列的对比表明这些分子的5’和3’区具有高度同源性，所以可以用为通用靶点序列区。在亲缘相近的生物体间，ssrA基因比其它细菌高拷贝数RNA有更显著程度的序列变异性。这些变异区可作为区分不同物种的核酸检验的理想靶点。本专利技术还提供了 tmRNA即ssrA基因的RNA转录序列或其片段用作为对原核生物或真核生物的核酸探针检验中的靶点区域。根据本专利技术这一方面的一个实施方案，tmRNA分子中与从tmRNA5’末端起的一段高同源性区相对应的片段能够作为通用靶点区。可替代地，tmRNA中与 从tmRNA 3’末端起的一段高同源性区相对应的片段能够作为通用靶点区。根据本专利技术这一方面的一个进一步实施方案，tmRNA分子中与低同源性区相对应的片段能够作为区分不同物种的核酸探针检验的靶点区。根据本专利技术的另一个进一步的实施方案，tmRNA分子中与低同源性区域相对应的片段能够作为用来产生属特异性探针的靶点区。根据本专利技术的核酸探针(DNA或RNA)典型地含有来自于ssrA基因或tmRNA转录序列或它们的互补序列的至少10个核苷酸，这些探针被用于真核生物或原核生物的核酸探针杂交检验。探针与它的互补序列的杂交典型地通过在核酸探针上标记上放射性或非放射性(如比色的或荧光的)标记物来揭示。在优选的实施方案中，所述的ssrA基因片段或tmRNA片段可作为用于扩增过程中所用的引物的基础。与ssrA基因或tmRNA序列的5’或3’区相对应的通用寡核苷酸引物可按照本专利技术使用，以便从广泛的细菌谱中扩增ssrA基因或它所编码的tmRNA，有助于实现大范围生物体的同时扩增，同时能使特异性的核酸探针发生杂交并进行检测。优选地，扩增过程的产物可以作为核酸探针检验中的靶点区。更加优选地，tmRNA分子的cDNA转录序列被作为探针用于核酸杂交检验。这种检测可以在体外完成或在原位完成。这里所定义的靶点区能够作为区分活的和死的原核生物或真核生物的检测的基础。与细菌死后存在于其细胞中的rRNA和mRNA不同，tmRNA在死亡的生物体中迅速降解。因此，tmRNA能够 作为有用的靶点来区分死的和活的原核生物或真核生物，S卩，通过核酸探针直接与分离的细菌RNA杂交或者通过将RNA扩增并将扩增产物和核酸探针杂交来将死的和活的原核生物或真核生物进行区分。优选地，靶点区本文档来自技高网...
【技术保护点】
微阵列基因芯片系统，所述微阵列基因芯片系统包含ssrA基因探针或tmRNA转录序列探针。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·杰勒德·巴里，特伦斯·詹姆斯·史密斯，
申请(专利权)人：爱尔兰公司爱尔兰生物研究，爱尔兰戈尔韦国立大学，
类型：发明
国别省市：
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