本发明专利技术属于猪的分子标记制备与应用技术领域，具体涉及一种与繁殖性状中特别是与猪初生重性状相关的分子标记的新用途。该分子标记是从HPSE基因中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，在该序列的80bp处有一个A\G等位基因突变，导致Alu?I-RFLP多态性。本发明专利技术公开了该分子标记的具体新用途的步骤。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于猪的分子标记制备与应用
，具体涉及一种猪繁殖相关性状特别是与猪初生重性状分子标记的应用。该分子标记与猪初生重性状相关，从HPSE基因中克隆得到，本专利技术主要涉及该分子标记的新用途。
技术介绍
猪是重要的经济动物，作为我国广大人民动物性蛋白的主要来源之一。近年来，人们对猪肉的消费量与日俱增，对于养猪生产者来说，如何提高生产性能、降低生产成本成了他们关注的焦点。在过去的几十年里，育种工作者通过常规的育种技术，对猪的许多重要经济性状进行了遗传改良，并取得了较理想的成果(如瘦肉率，背膘厚等)。但是对于猪繁殖性状的改良进度很缓慢，且效果不是很明显，没有取得预期的实质性突破。分子生物学技术的迅速发展为此提供了重要的契机，凭借这一技术手段，科学家们发掘出了一大批与猪的初生重，生长速度，断奶重，产仔数等重要的繁殖性状有着显著关联的分子标记。这为提高猪的生产性能提供了理论依据，并从实质上使之得到了很大的提闻。猪的初生重作为一个重要的繁殖性状，对猪出生后的生长速度及成活率具有重要的作用。最近有很多文献报道了初生重对猪出生后生长速度的影响，李剑豪(李剑豪.长白猪初生重对生长速度及哺育率的影响.仔猪生产[J].2006.18)研究发现长白猪60日龄重与35日龄重均与初生重呈正相关且初生重与生长速度呈正相关。Beaulieu等(BeaulieuAD 等，Impact of piglet birth weight, birth order and litter size on subsequentgrowth performance， carcass quality, muscle composition and eating quality ofpork[J].J Anim Sc1.2010)和 Poore 等(Poore K.R.等，The effects of birth weightand postnatal growth patterns on fat depth and plasma leptin concentrations injuvenile and adult pigs.J.Physiol.2004)研究发现,初生重较低的猪生长速度较慢,从而使其进入市场的时间增加。另有研究表明仔猪的初生重与育成率亦悉悉相关，初生重在 1.0Kg以下时仔猪育成率随着初生重的增加而上升；初生重在1.0Kg以上时仔猪育成率没有明显的规律。初生重小于等于0.5Kg时仔猪育成率仅为55.56% (高建国.二花脸猪初生重对出生后生长速度及育成率的影响[J].畜牧与兽医，1992，24(1):26),Gondret,F.L.等(Gondret,F.L.等，Low birth weight is associated with enlarged muscle fiber areaand impaired meat tendesness of the longissimus muscle in pigs.J.Anim.Sc1.2006)和Wolter 等(Wolter,B.F.等 The effect of birth weight and feeding of supplementmilk replacer to piglets during lactation on preweaning and postweaning growthperformance and carcass characteristic.J.Anim.Sc1.2002)研究报道称,猪出生重与出生后早期的生长速度相关，初生重小的胎儿初生重大的胎儿更虚弱，出生后需要更好地环境条件来保证它的存活。因此，对猪初生重相关基因的克隆和鉴定可为解释猪和其它哺乳动物胎儿生长发育的遗传机制提供重要线索，并为猪的繁殖性状遗传改良提供理论依据。猪在妊娠期，绒毛膜上皮和子宫内膜上皮形成皱褶，褶皱折叠水平影响着胎盘的相对大小，胎盘的相对大小是影响胎儿存活的主要因素之一，胎儿的存活率又与猪初生重具有重要的关系。粘多糖(Glycosaminoglycans,GAG)是ECM的主要组成成分之一,硫酸类肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans, HPSGs)在胚胎发育、形态发生、血管生成、上皮间叶细胞间的相互作用中起着主要作用，肝素蛋白酶(heparannase, HPSE)是一类可以裂解连接于HPSGs核心分子上硫酸肝素的一类内切糖苷酶，HPSE主要降解硫酸类肝素，是猪胎盘中最丰富的一种糖胺聚糖(GAG)。即HPSE可以降解胎盘基质，使胎盘更好的发育形成，为胎儿的发育创造了良好的条件，进而影响胎儿的初生重，最终影响胎儿出生后的成活和生长速度。因此推测HPSE可能与胎儿的初生重具有重要的关系。与本专利技术密切相关的研究成果是本申请人(专利权人)前期工作的基础，在申请人华中农业大学2010年公开的专利文献中(公开号:CN101892225A，公开日:2010.11.24)，涉及到一种专利技术名称为HPSE基因作为猪免疫性状相关的分子标记及其应用(专利号:ZL 201010223062.0)该专利文献报道了利用HPSE基因的特异片段检测猪免疫性状的关联分析和应用。但该分子标记并未涉及与猪繁殖性状特别是与猪初生重相关性状关联分析中的应用(用途)。
技术实现思路
专利技术的目的在于寻找HPSE基因的片段作为一个分子标记在猪初生重性状关联分析中的应用。本专利技术通过以下技术方案实现:一种分子标记Alu 1-RFLP在猪初生重性状关联分析中的应用，其步骤如下所述:I)用人HPSE基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80%以上的表达序列标签(EST)，然后对EST进行拼接；提取猪肺脏组织总RNA并做cDNA第一链反转录；设计引物对，该引物对的正向引物为5 ’ -AGCCAGGTGAGCCCGAGATG-3 ’，反向引物为5’ -GCATCTGCTCGTGTTCCTAC-3’ (见序列表 SEQ ID NO:9，10)，用 RT-PCR 方法扩增猪 HPSE基因的cDNA片段，PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；2)根据SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列设计引物对，该引物对的核苷酸序列如下所示:正向引物:5 ' -GGATGAAGGCTGGTATTT-3 '，反向引物:5' -TGGGATAAGGCAATACAG-3'(见序列表 SEQ ID NO:3，4)，扩增猪基因组 DNA，将 PCR 产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如下所述的核苷酸序列:GGATGAAGGCTGGTATTTACATTGATGGATTTCAGTTAGGAGAAGATTTTATTGACTTGCACAAACTTCTAAGAAAATCRGCTTTCAAAAATGCAAAACTCTATGGTCCTGATATTAGCCAGCCTCGACGAAAGAATGCTGAGATGCTGAAGAGGTAAGAGTGAGAGGAAGCAGA ACCACTTTTCTTAAAAATAATATTTTCCTGTGGTGGAGACTCCTCAACAAACCACCTAA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分子标记Alu?I?RFLP在猪初生重性状关联分析中的应用，其特征在于下列步骤：1)用人HPSE基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80％以上的表达序列标签(EST)，然后对EST进行拼接；提取猪肺脏组织总RNA并做cDNA第一链反转录；设计引物对，该引物对的正向引物为5’?AGCCAGGTGAGCCCGAGATG?3’，反向引物为5’?GCATCTGCTCGTGTTCCTAC?3’，用RT?PCR方法扩增猪HPSE基因的cDNA片段，PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列；2)根据SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列设计引物对，该引物对的核苷酸序列如下所示：正向引物：5′?GGATGAAGGCTGGTATTT?3′，反向引物：5′?TGGGATAAGGCAATACAG?3′，扩增猪基因组DNA，将PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如下所述的核苷酸序列：GGATGAAGGCTGGTATTTACATTGATGGATTTCAGTTAGGAGAAGATTTTATTGACTTGCACAAACTTCTAAGAAAATCRGCTTTCAAAAATGCAAAACTCTATGGTCCTGATATTAGCCAGCCTCGACGAAAGAATGCTGAGATGCTGAAGAGGTAAGAGTGAGAGGAAGCAGAACCACTTTTCTTAAAAATAATATTTTCCTGTGGTGGAGACTCCTCAACAAACCACCTAATATTAAACGATTTGCTGCCTGACTTGAAGGTTTACCAAAAGAGGAAACAGTGATTGGCTCAGAAGACCAAAGATTTTGTGACAAATGGCACCATGATAAAATTTGTTTCAGAATTAGGAAGTCTGTATTGCCTTATCCCA上述序列中的R是A或G，导致Alu?I?RFLP多态性；3)检测目的基因HPSE?mRNA在猪胎盘绒毛膜组织样中转录水平的表达，设计用于检测目的基因HPSE?mRNA表达水平的引物对以及作为内参基因GAPDH的引物对，其核苷酸序列分别如下所示：目的基因HPSE的引物对：正向引物：5′GTTTGTCTCCCGCATACCTGA?3′，反向引物：5′CAAGTCCAGTCCTGAGCAAT?3′；内参基因GAPDH的引物对：正向引物：5′ATCCCGCCAACATCAAAT3′，反向引物：5′CACGCCCATCACAAACAT3′；4)定位目的基因HPSE基因的mRNA在猪胎盘组织的表达位置；5)应用PCR?RFLP方法对序列表SEQ?ID?NO：1的第80位碱基进行检测，然后对基因型与猪初生重性状进行关联分析。...
【技术特征摘要】
1. 一种分子标记Alu I-RFLP在猪初生重性状关联分析中的应用，其特征在于下列步骤 1)用人HPSE基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80%以上的表达序列标签(EST)，然后对EST进行拼接；提取猪肺脏组织总RNA并做cDNA第一链反转录；设计引物对，该引物对的正向引物为5 ’ -AGCCAGGTGAGCCCGAGATG-3 ’，反向引物为5’ -GCATCTGCTCGTGTTCCTAC-3’，用 RT-PC...
【专利技术属性】
技术研发人员：余梅，侯春艳，刘榜，赵书红，王维民，李小平，李新云，曹建华，李长春，朱猛进，洪林君，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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