本发明专利技术公开了一种地衣芽孢杆菌，其分类命名为地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）7172，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?NO.7172，保藏日期2013年1月18日，保藏地址中国北京。本发明专利技术的地衣芽孢杆菌7172及其应用，使用地衣芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素是在高温条件下进行的，可以有效控制杂菌的生长，有利于工业生产。同时采用该方法环境污染小，生产周期短，产品环境友好，安全可靠，克服了长期以来采用化学合成法生产香兰素的弊端，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种地衣芽孢杆菌7172及其应用。
技术介绍
香兰素(vanillin)，学名4_羟基_3_甲氧基苯甲醛，分子式C8H8O3，相对分子量152.15。香兰素的纯品通常为白色或微黄色针状结晶，具有香荚兰豆特有的芳香味。微溶于水，易溶于乙醇、氯仿、乙醚、冰醋酸、吡啶等有机溶剂和强碱溶液中。香兰素的化学性质不太稳定，易受光的影响，在空气中逐渐氧化为香草酸，在碱性溶液中易变色。无毒，对人和动物无害，对皮肤和粘膜有局部的刺激。香兰素是一种世界上产量最大、用途最多的广谱型高档香料，已广泛应用于食品、医药、工业、农业等各个行业中。在食品方面，因其具有特殊的香型，被誉为“食品香料之王”，广泛用作咖啡、名酒等高档食品的调香原料。在医药方面，香兰素是合成许多药物及其药物中间体的重要原料。在工业方面，香兰素被广泛的应用于牙膏、香水及化妆品的制备中；香兰素用作电镀添加剂，可加快电镀速度，增加镀件表面的光泽。在农业方面，香兰素可作为农作物的增产剂、催熟剂等。香兰素目前主要由化学方法制备，但用化学合成法制得的香兰素不是天然香料。天然香兰素可以从香子兰的花荚中提取，但这样得到的香兰素量少而价高，不能满足日益增长的需求，从而促使研究人员去寻找生产天然香兰素的替代方法。国外(例如欧洲)的立法机构认为采用生物活细胞或其中的组成部分(例如酶)等生物资源所生产的物质均属于天然产物。因此利用生物转化法生产天然香兰素是很有前途的替代方法之一。目前，利用微生物转 化法生产香兰素所选用的天然底物主要有阿魏酸、丁香酚、异丁香酚、芳香族氨基酸、香草酸等。阿魏酸因其对微生物的毒性作用小，并且在自然界广泛分布，被认为是一种较好的底物。迄今为止，以阿魏酸为底物生产香兰素的微生物种类很多，在细菌、真菌、放线菌中都有发现。但大多数微生物转化得到的香兰素的产量很低，或者是香兰素很快转化成其它的代谢产物，导致香兰素在培养液中很难积累下来。
技术实现思路
专利技术目的:针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种地衣芽孢杆菌7172及其应用。技术方案:为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下: 一种地衣芽孢杆菌，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 7172,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7172，保藏日期2013年I月18日，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号。地衣芽孢杆菌7172的生理学特征是:革兰氏阳性，好氧，产芽孢，平坦，不透明，可利用麦芽糖、淀粉、葡萄糖。取地衣芽抱杆菌7172 的 16S rRNA 序列与 Bacillus licheniformis 的 16S rRNA序列比对，相似性达到100%,因此鉴定为地衣芽孢杆菌licheniformis.、 所述的地衣芽孢杆菌在生物转化阿魏酸生产天然香兰素中的应用。所述的应用，其特征在于，包括以下步骤: (1)斜面培养:将地衣芽孢杆菌7172接种到斜面培养基上，在50°C、pH7条件下，静置培养24h ； (2)制备种子培养液:用步骤(I)所得到的斜面培养物，接种到种子液培养基中，在50°C条件下，200rpm振荡培养24h，连续转接I 3次，制得种子培养液； (3)菌体的发酵培养:使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比1%的接种量接入发酵培养液中，在50°C条件下，200rpm振荡培养20h ； (4)菌体的收集:将步骤(3)所得到的发酵液在6000rpm的条件下离心，弃上清，得到沉淀物，即菌体； (5)菌体的转化:将步 骤(4)所得的菌体用磷酸盐缓冲液冲洗三次，再用相同的磷酸盐缓冲液进行悬浮培养，同时加入8g/L的阿魏酸钠溶液，在50°C条件下，200rpm振荡培养5d，获得天然香兰素。所述斜面培养基配方为:酵母提取物5g/L, Tryptone 10g/L,氯化钠5g/L,琼脂18g/L。所述种子液培养基配方为:酵母提取物5g/L, Tryptone 10g/L,氯化钠5g/L。所述发酵培养基配方为:酵母提取物5g/L, Tryptone 10g/L,氯化钠5g/L;pH调至7。所述磷酸盐缓冲液的成份为:4.2mM Na2HPO4, 2.2mM KH2PO4,0.9mM NaCl, 1.9mMNH4Cl, pH 为 7。所述的阿魏酸钠溶液是将阿魏酸溶于磷酸盐缓冲液中，再用NaOH调节pH至7。有益效果:与现有技术相比，本专利技术的地衣芽孢杆菌7172及其应用，使用地衣芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素是在高温条件下进行的，可以有效控制杂菌的生长，有利于工业生产。同时采用该方法环境污染小，生产周期短，产品环境友好，安全可靠，克服了长期以来采用化学合成法生产香兰素的弊端，具有广泛的应用前景。附图说明图1是地衣芽孢杆菌7172在平板培养基上的生长 图2是地衣芽孢杆菌转化阿魏酸生成的代谢产物的薄层层析图；图中，I为阿魏酸标样,2为香兰素标样，3为4-乙烯基愈创木酚标样，4为培养IOh的发酵液，5为培养2d的发酵液； 图3是气相色谱-质谱联用检测发酵液中代谢产物结果 图4是地衣芽孢杆菌转化阿魏酸生产香兰素的过程中阿魏酸和香兰素的变化曲线图。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1取蘑菇种植地中的堆肥样品，称取6g，剪碎，加入60mL蒸馏水，混匀制成悬浊液，于30°C条件下震荡培养30min。取上述制得的悬浊液转接到阿魏酸的浓度分别为0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%的基本培养基中，将三角瓶置于50°C水浴摇床中振荡培养，并观察其生长状况。将上述初筛的阿魏酸浓度为0.1%-0.5%的培养液各取lmL，转接到新配置的阿魏酸浓度为0.4%，0.5%，0.6%, 0.7%, 0.8%的复筛培养基中，进一步提高阿魏酸的浓度，将三角瓶置于50°C水浴摇床中振荡培养。从上述阿魏酸浓度为0.1%-0.8%的培养液中各取IOML菌液，并用无菌蒸馏水适当稀释后涂板，50°C高温水浴摇床培养l-3d，然后从板上挑取形态不同的单个菌落，采用平板划线法进行纯化，连续纯化3次，以确保得到单一菌落。将长出的单菌落分别接种到含5g/L阿魏酸的基本培养基中，振荡培养24小时后，筛选出能够转化阿魏酸生成香兰素菌株，最终获得一株降解能力较好、能大量积累香兰素的菌株。采用菌落PCR法获得该菌株的16SrDNA，具体如下: 1)16sRNA扩增引物使用细菌16sRNA通用引物， 正向引物 F27:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 反向引物 R1492:5’ -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-32)PCR体系(25ML):2.5ML IOXbuffer (Mg2+ Free)，2ML dNTP，1.5ML MgCl2，0.3ML 正向引物F27，0.3ML反向引物R1492，5ML模板(单菌落)，0.3ML T aq DNA酶，13.1ML无菌蒸馏水； 3)反应程序:95°C预变性5min;95°C变性30S ;55°C退火Imin ;72°C延伸2min ；30个循环；72°C再延伸IOmin ;4°C保存。将PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种地衣芽孢杆菌，其分类命名为地衣芽孢杆菌（Bacillus?licheniformis）7172，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?NO.7172，保藏日期2013年1月18日，保藏地址中国北京。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁少军，保华荣，胡宏飞，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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