一种琼脂糖免疫磁性微球的制备方法及其应用技术

一种琼脂糖免疫磁性微球的制备方法及其应用，涉及一种微球的制备方法及其应用。本发明专利技术是要解决现有纯化的单克隆抗体的过程复杂，收率低，成本高且偶联剂有剧毒的技术问题。制备方法：一、制备油酸铁前驱体；二、制备磁流体；三、制备油相和水相；四、制备琼脂糖磁性微球；五、制备活化交联的琼脂糖磁性微球；六、制备接入间隔臂的琼脂糖磁性微球；七、制备琼脂糖免疫磁性微球。本发明专利技术的一种琼脂糖免疫磁性微球用于纯化基因工程重组曲妥珠单克隆抗体。本发明专利技术制备琼脂糖免疫磁性微球应用于单克隆抗体分离纯化领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种微球的制备方法及其应用。
技术介绍
单克隆抗体是指由单一克隆杂交瘤细胞产生的只识别某一特定抗原表位的同源抗体。是经过人工制备的一类特殊抗体，其本质是球蛋白，具有球蛋白的各种理化性质、空间结构和生物学活性，具有可变区和恒定区:可变区结合抗原，形成抗原抗体复合物；恒定区有补体结合位点，介导补体发挥作用，形成攻膜复合物，杀伤变异的细胞.单克隆抗体具有一般抗体的性质，是由B细胞增殖分化为浆细胞时所产生的一类球蛋白，存在于体液中，具有免疫功能，能够介导体液免疫，与相应抗原(如病原体)发生特异性结合，并在其他免疫分子和细胞的参入下发挥免疫效应.。单克隆抗体除了具有抗体的一般性质外，还具有其特殊的优点:理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易、易于体外大量制备和纯化等优点。这些优点使它一问世就受到高度重视，并广泛应用于生物学和医学研究领域，有广阔的发展前景。IgG是人体免疫球蛋白的一种，是唯一可以通过胎盘的免疫球蛋白，是血清主要的抗体成分，约占血清的75%。其中40 50%分布于血清中，其余的分布在各种组织中。IgG的功能作用主要在机体免疫中起保护作用。大多数抗病毒、抗毒素和抗菌抗体均属于IgG类。能够应对麻疹、甲型肝炎等疾病，并能有效地预防相应的感染性疾病。因此，在中和毒素、抗细菌、抗病毒、对抗 癌细胞方面，IgG类抗体起着重要作用。曲妥珠是重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，属IgG1型，它可以选择性地作用于人表皮生长因子受体_2(HER2)的细胞外部位。通过将自己附着在Her2上来阻止人体表皮生长因子在Her2上的附着，从而阻断癌细胞的生长，同时还可以刺激身体自身的免疫细胞去摧毁癌细胞。事目前配合放化疗治疗乳腺癌的特效药物。虽然基因从组的单克隆抗体可以在体外人为控制实现批量生产，但是其分离纯化过程十分复杂，需经过细胞破碎、离心分离、盐析沉淀、溶解沉淀、疏水层析、阴阳离子交换层析和凝胶过滤层析等处理才能获得较高的纯化效率，耗时长、浪费大量人力、物力，由于分离过程步骤多，造成了产品收率较低以及成本高等缺点。因此，开发能够简单、快速分离纯化抗体的新技术已成为当今生物领域的主流。目前，一些公司通常采用亲和层析以提高纯化效率和特异性，但在亲和层析之前也要经过盐析、疏水或离子交换层析等处理才一能获得较高的纯化效率。另外，亲和层析介质同特异性抗体的连接多采用据毒的澳化氰作为偶联剂，增加了工艺的危险性。为克服上述缺点，本专利技术在现今最常用的亲和层析法的基础上进行优化改良，为蛋白类基因工程产物的分离纯化开辟了一条新的途径。琼脂糖是十分理想的亲和层析介质，其表面不带电荷，非特异性吸附能力极小，在缓冲液离子强度》0.05mol/L时，对蛋白质类几乎没有特异性吸附作用，并且具有较好的亲水性，可以使生物分子易于靠近并与配体作用，且不会使生物分子丧失活性。
技术实现思路
本专利技术是要解决现有纯化的单克隆抗体的过程复杂，收率低，成本高且偶联剂有剧毒的技术问题，从而提供了一种琼脂糖免疫磁性微球的制备方法及其应用。本专利技术的一种琼脂糖免疫磁性微球的制备方法及其应用是按以下步骤进行:一、取10 15g的FeC13.6H20和30 50g的油酸纳溶解在混合溶剂中，加热至60 80°C，保温4 6h，反应完成后，取上层有机溶剂用蒸馏水洗涤三次，旋蒸去除有机溶齐U，得到油酸铁前驱体；其中，混合溶剂由乙醇、蒸馏水和正己烷按体积比60 80: 40 60: 120 140混合而成；二、室温下，将30 40g的油酸、5 8g的步骤一得到的油酸铁前驱体和100 200g的十八烯混合，再以每分钟3 5°C的升温速度加热到320 340°C，并保温20 50min,然后自然冷却至室温,加入400 600mL的无水乙醇,在3000 5000rpm的转速下离心分离10 15min,得到磁流体；三、称取20 50mL的液体石腊、5 IOmL的石油醚以及I 2g的表面活性剂span-80,预热至60 80°C ，作为油相；将0.2 1.0g的琼脂糖，0.5 1.2g的氯化钠加入到5 15mL的蒸馏水中，加热溶解，配制琼脂糖质量浓度为3%的琼脂糖水溶液作为水相；四、取0.05 0.5g的步骤二得到的磁流体加入到步骤三得到的水相中，超声分散后，转移到步骤三得到的油相中，在3000 5000rpm的转速下搅拌10 30min，然后迅速冷却至室温，得到琼脂糖磁性微球；五、取4 6g的步骤四得到的琼脂糖磁性微球加入到混合溶液中，室温下反应20 40min，得到水解后的琼脂糖磁性微球溶液，然后向琼脂糖磁性微球溶液中加入二甲基亚砜和环氧氯丙烷，至二甲基亚砜的体积分数为40% 60%，环氧氯丙烷的体积分数为20%，在20 40°C恒温震荡反应8 12h，得到活化交联的琼脂糖磁性微球；其中，混合溶液由9 Ilmg的硼氢化钠和8 IOmL的氢氧化钠溶液组成；六、取4 6g的步骤五得到的活化交联的琼脂糖磁性微球，加入8 12mL的氨水，室温下反应4 6h，将氨解后的微球洗净抽干，然后加入9 12mL的戊二醛，室温下震荡反应I 3h，用蒸馏水洗净过量的戊二醛，得到接入间隔臂的琼脂糖磁性微球；七、取2 4g的步骤六得到的接入间隔臂的琼脂糖磁性微球加入到5 15mL的含有20 30g蛋白A的NaHCO3-NaCO3缓冲液中，4°C反应过夜后，用蒸馏水将微球冲洗干净，然后加入5 IOmL的lmol/L的乙醇胺溶液，在温度为28 37°C下反应2 6h，然后加入5 IOmL的lmg/mL的牛血清蛋白反应，最后用蒸馏水洗净，得到琼脂糖免疫磁性微球。本专利技术的一种琼脂糖免疫磁性微球的应用为用于纯化基因工程重组曲妥珠单克隆抗体。本专利技术包括以下有益效果:1、利用本专利技术制备的琼脂糖免疫磁性微球纯化基因工程重组曲妥珠单克隆抗体，可省去传统层析方法必须的预过滤步骤，大幅度减少预处理时间，并提高产品收率，降低成本；操作简便、快速，无须对样品进行复杂的前处理，未加入磁场前，微球可以均匀的悬浮于裂解液中，加入磁场后，可以直接将微球从发酵菌体的裂解液中迅速分离出来，撤去磁场后磁性迅速消失，不影响目标蛋白的分离；2、利用本专利技术制备的琼脂糖免疫磁性微球可以一步纯化得到高纯度目标的蛋白，大大简化分离纯化步骤，提高产品收率，并且分离纯化条件温和，磁球可以回收，重复多次使用；本专利技术可替代免疫亲和层析柱，成为一种快速、高效分离纯化基因重组抗体的的新技术；3、本专利技术用环氧氯丙烷代替剧毒的溴化氰活化交联琼脂糖微球，降低了工艺的危险性，在体系中加入了水溶性的有机试剂二甲基亚砜，二甲基亚砜具有高热稳定性、低毒、低腐蚀等特点，不仅与水完全混溶，而且对于多种色谱配基亦有很好的溶解性，二甲基亚砜的加入大大提高了环氧氯丙烷的溶解度，可使活化密度提高2倍以上，从而大幅度提高了蛋白质的纯化率；以戊二醛作为交联臂，偶联特异性吸附极强的金黄色葡萄球菌蛋白A作为配基，可特异性吸附IgG型抗体；4、本专利技术制备的琼脂糖免疫磁性微球表面连接间隔臂使配基与微球表面分开，并使配基较为均勻的分布在微球表面，在充分降低空间位阻的同时也降低了微球对配基的非特异性吸附作用，可快速完成吸附过程，再外加磁场的作用下，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种琼脂糖免疫磁性微球的制备方法，其特征在于琼脂糖免疫磁性微球的制备方法是按以下步骤进行：一、取10～15g的FeCl3·6H2O和30～50g的油酸纳溶解在混合溶剂中，加热至60～80℃，保温4～6h，反应完成后，取上层有机溶剂用蒸馏水洗涤三次，旋蒸去除有机溶剂，得到油酸铁前驱体；其中，混合溶剂由乙醇、蒸馏水和正己烷按体积比60～80∶40～60∶120～140混合而成；二、室温下，将30～40g的油酸、5～8g的步骤一得到的油酸铁前驱体和100～200g的十八烯混合，再以每分钟3～5℃的升温速度加热到320～340℃，并保温20～50min，然后自然冷却至室温，加入400～600mL的无水乙醇，在3000～5000rpm的转速下离心分离10～15min，得到磁流体；三、称取20～50mL的液体石蜡、5～10mL的石油醚以及1～2g的表面活性剂span?80，预热至60～80℃，作为油相；将0.2～1.0g的琼脂糖，0.5～1.2g的氯化钠加入到5～15mL的蒸馏水中，加热溶解，配制琼脂糖质量浓度为3％的琼脂糖水溶液作为水相；四、取0.05～0.5g的步骤二得到的磁流体加入到步骤三得到的水相中，超声分散后，转移到步骤三得到的油相中，在3000～5000rpm的转速下搅拌10～30min，然后迅速冷却至室温，得到琼脂糖磁性微球；五、取4～6g的步骤四得到的琼脂糖磁性微球加入到混合溶液中，室温下反应20～40min，得到水解后的琼脂糖磁性微球溶液，然后向琼脂糖磁性微球溶液中加入二甲基亚砜和环氧氯丙烷，至二甲基亚砜的体积分数为40％～60％，环氧氯丙烷的体积分数为20％，在20～40℃恒温震荡反应8～12h，得到活化交联的琼脂糖磁性微球；其中，混合溶液由9～11mg的硼氢化钠和8～10mL的氢氧化钠溶液组成；六、取4～6g的步骤五得到的活化交联的琼脂糖磁性微球，加入8～12mL的氨水，室温下反应4～6h，将氨解后的微球洗净抽干，然后加入9～12mL的戊二醛，室温下震荡反应1～3h，用蒸馏水洗净过量的戊二醛，得到接入间隔臂的琼脂糖磁性微球；七、取2～4g的步骤六得到的接入间隔臂的琼脂糖磁性微球加入到5～15mL的含有20～30g蛋白A的NaHCO3?NaCO3缓冲液中，4℃反应过夜后，用蒸馏水将微球冲洗干净，然后加入5～10mL的1mol/L的乙醇胺溶液，在温度为28～37℃下反应2～6h，然后加入5～10mL的1mg/mL的牛血清蛋白反应，最后用蒸馏水洗净，得到琼脂糖免疫磁性微球。...

【技术特征摘要】
1.一种琼脂糖免疫磁性微球的制备方法，其特征在于琼脂糖免疫磁性微球的制备方法是按以下步骤进行: 一、取10 15g的FeC13.6H20和30 50g的油酸纳溶解在混合溶剂中，加热至60 80°C，保温4 6h，反应完成后，取上层有机溶剂用蒸馏水洗涤三次，旋蒸去除有机溶齐U，得到油酸铁前驱体；其中，混合溶剂由乙醇、蒸馏水和正己烷按体积比60 80: 40 60: 120 140混合而成； 二、室温下，将30 40g的油酸、5 8g的步骤一得到的油酸铁前驱体和100 200g的十八烯混合，再以每分钟3 5°C的升温速度加热到320 340°C，并保温20 50min，然后自然冷却至室温，加入400 600mL的无水乙醇,在3000 5000rpm的转速下离心分离10 15min,得到磁流体； 三、称取20 50mL的液体石腊、5 IOmL的石油醚以及I 2g的表面活性剂span-80,预热至60 80°C，作为油相；将0.2 1.0g的琼脂糖，0.5 1.2g的氯化钠加入到5 15mL的蒸馏水中，加热溶解，配制琼脂糖质量浓度为3%的琼脂糖水溶液作为水相； 四、取0.05 0.5g的步骤二得到的磁流体加入到步骤三得到的水相中，超声分散后，转移到步骤三得到的油相中，在3000 5000rpm的转速下搅拌10 30min，然后迅速冷却至室温，得到琼脂糖磁性微球； 五、取4 6g的步骤四得到的琼脂糖磁性微球加入到混合溶液中，室温下反应20 40min,得到水解后的琼脂糖磁性微球溶液，然后向琼脂糖磁性微球溶液中加入二甲基亚砜和环氧氯丙烷，至二甲基亚砜的体积分数为40 % 60 %，环氧氯丙烷的体积分数为20 %，在20 40°C恒温震荡反应8 12h，得到活化交联的琼脂糖磁性微球；其中，混合溶液由9 Ilmg的硼氢化钠和8 IOmL的氢氧化钠溶液组成； 六、取4 6g的步骤五得到的活化交联的琼脂糖磁性微球，加入8 12mL的氨水，室温下反应4 6h，将氨解后的微球洗净抽干，然后加入9 12mL的戊二醛，室温下震荡反应I 3h，用蒸馏水洗净过量的戊二醛，得到接入间隔臂的琼脂糖磁性微球； 七、取2 4g的步骤六得到的接入间隔...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵九蓬，侯雪梅，李垚，马丽华，潘磊，赵长杰，
申请(专利权)人：哈尔滨益材新材料有限公司，
类型：发明
国别省市：