用于自身免疫疗法的树突细胞的基于微球的递送和离体操作制造技术

本发明专利技术涉及致耐受性的哺乳动物树突细胞(iDC)和用于产生致耐受性DC的方法。此外，本发明专利技术提供了用于向哺乳动物受试者给予致耐受性树突细胞和包含寡核苷酸的颗粒的方法。宿主中增强的致耐受性可用于治疗炎症和自身免疫相关疾病，例如1型糖尿病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】交叉引用本申请要求2013年11月18日提交的美国临时申请第61/905,787号的优先权，其通过引用的方式全文纳入本文。关于联邦政府赞助研究的声明本专利技术是在NIDDKDK063499和NIDDKDK49835-01的政府支持下做出的，这二者均由国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予。政府对本专利技术享有某些权利。
技术介绍
糖尿病是由内源性胰岛素缺乏或胰岛素受体缺陷导致细胞不能跨膜运输内源葡萄糖而造成的。1型糖尿病是由β细胞的破坏造成的，其导致内源胰岛素水平不足。1型糖尿病选择性地损害和破坏产生胰岛素的胰脏β细胞。随后的胰岛素缺乏导致血糖水平升高。2型糖尿病可能起因于胰岛素受体本身缺陷或所存在的胰岛素受体数目不足或胰岛素和胰高血糖素的信号之间失去平衡，但是其最终是由功能性β细胞的缺失引起的。目前对于具有糖尿病临床表现的个体的治疗尝试模拟非糖尿病个体中胰脏β细胞的作用。尽管有这样的干预，糖尿病人的健康状况仍常常逐渐下降。糖尿病仅在美国就折磨着数百万的人，依然需要另外的治疗1型糖尿病的方法。
技术实现思路
本公开内容提供了用于治疗患有疾病的哺乳动物的方法、组合物和试剂盒。所述方法、组合物和试剂盒尤其可用于治疗发生或可能发生糖尿病的哺乳动物。在一些方面，本文提供了用于使幼年哺乳动物(pediatricmammal)的血糖恢复至患糖尿病前的水平的方法，其包括：在哺乳动物中接近胰淋巴结或胰脏的一个或多个注射部位给予致耐受性树突细胞的两次或更多次皮下注射，其中所述血糖可恢复至所述患糖尿病前的水平，持续至少二十四小时的时间。在一些实施方案中，所述致耐受性树突细胞可以分离自所述哺乳动物或者分离自不同的哺乳动物。在一些实施方案中，所述致耐受性树突细胞可以是预先冷冻的。附图说明图1A和图1B是AS寡核苷酸和聚L赖氨酸聚阳离子的微球的扫描电子显微照片。图2A是概括微球制品的粒度分布的图表。图2B是概括微球制品的表面电荷的图表。图3是微球解析(deformulation)后寡核苷酸的RP-HPLC色谱图。图4A是涂覆有反义寡核苷酸的微球的自组装系统的示意图。图4B是概括未涂覆微球的平均粒度分布的图表。图4C是概括反义寡核苷酸涂覆的微球的平均粒度分布的图表。图5包括两张含FITC缀合的NF-kBODN的树突细胞(DC)的显微镜图像；左图是相差图像，右图是荧光图像。图6是示出了来自NOD小鼠的DC的免疫刺激能力被NF-kODN显著抑制的图表。图7是示出了NF-kBODNDC给药能防止NOD小鼠中发生1型糖尿病发展的图表。图8A是概括用含反义寡核苷酸的微球治疗的新发病糖尿病小鼠的血糖水平的图表。图8B是概括用含混杂寡核苷酸(scrambledoligonucleotide)的微球治疗的新发病糖尿病小鼠的血糖水平的图表。图9A是使用患有新发病糖尿病的小鼠进行的实验的时间线。图9B-图9C是概括用AS-MSP或对照治疗的新发病糖尿病小鼠的平均血糖水平的图表。图10A-图10C是示出给予AS-MSP后15天内NOD小鼠中1型糖尿病表型的逆转的图表。图11是描绘自身免疫性糖尿病的治疗逆转的流程图。图12A是IVISLumina工作站中概括活体动物成像的图。图12B是概括在胰脏上注射后小鼠荧光素标记的微球的局部积累的图。图12C是概括两天中小鼠中荧光素标记微球的荧光积累的图。图12D是概括两天中不同小鼠中荧光素标记微球的荧光积累的图。图13是概括在胰脏远端注射到小鼠中后荧光标记微球的局部积累的图。图14是概括非人灵长类动物中荧光标记微球的注射部位位置的图。图15A-C是概括非人灵长类动物的胰淋巴结内荧光标记微球的优势积累的图。图16是概括小鼠中注射后荧光标记的致耐受性树突细胞(iDC)的局部积累的图。图17是概括非人灵长类动物中荧光标记的iDC的注射部位位置的图。图18是概括非人灵长类动物中注射后荧光标记的iDC的局部积累的图。图19是概括人中注射部位位置的图。图20A是概括新发病的1型糖尿病小鼠数周内的血糖水平的图表。图20B是概括新发病的糖尿病小鼠中胰岛素撤销后的血糖水平的图表。图21A是用于鉴别和测量B细胞群的频率的流式细胞计数方法。图21B是新鲜收集的胰淋巴结细胞的流式细胞计数数据。图21C是概括通过流式细胞术得到的表示为总脾细胞的％的DC-Bregs频率的图表。图21D是概括在未处理的、对照树突细胞(cDC)注射的和iDC注射的小鼠的脾中通过流式细胞术测量的DC-Bregs的绝对数的图表。图21E是概括通过流式细胞术测量的表示为总脾细胞的％的B10Bregs频率的图表。图21F是概括在未处理的、cDC注射的和iDC注射的小鼠的脾中通过流式细胞术测量的B10Bregs的绝对数的图表。图21G是苏木精/伊红染色的B10Bregs的显微图像。图22A是概括在抑制性B细胞群不存在或存在的情况下共培养的BrdU阳性T细胞的频率的图表。图22B是概括具有和不具有中性IL-10抗体的在同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)中与抑制性B细胞群共培养的BrdU阳性T细胞的频率的图表。图22C是概括在同种异体MLR中与通过Transwell插入物(insert)物理分离的抑制性B细胞群共培养的BrdU阳性T细胞的频率的图表。图23A是测量与cDC、iDC和培养基共培养5天后DC-Bregs的绿色荧光蛋白(GFP)荧光的流式细胞计数数据。图23B是概括高度纯化的GFP-起始群与培养基、cDC或iDC共培养后体外GFP+DC-Bregs的实际数目的图表。图23C是概括高度纯化的GFP+起始群与培养基、cDC或iDC共培养后体外GFP+DC-Bregs的实际数目的图表。图24是来自非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠的脾DC-Bregs的流式细胞计数数据。图25是概括在同基因B细胞和同种异体脾细胞存在或不存在的情况下，通过流式细胞术测量的BrdU阳性T细胞的频率的图表。图26A是概括与B10Bregs中的表达相比的视黄酸受体(RARα)的表达的图表。图26B是概括与B10Bregs中的表达相比的类视黄醇X受体(retinoidXreceptor，RXR)的表达的图表。图27A是测量产生RA的细胞(包括cDC和iDC)的ALDEFLUOR荧光的流式细胞计数分析。图27B是概括在cDC和iDC存在的情况下培养的RA响应元件(RARE)-Luc质粒转染的HEK293细胞中荧光素酶活性的发光监测的图表。序列表所附序列表列出的核酸序列和氨基酸序列是使用37C.F.R.1.822中限定的用于核苷酸碱基的标准字母缩写和用于氨基酸的三字母代码示出。仅示出了每个核酸序列的一条链，但是应理解，适当时互补链通过参考所示出的链也被包括在内。序列表是作为ASCII文本文件[92198-02_Sequence_Listing，November18，2014，12.0KB]提交，其通过引用的方式纳入本文。具体实施方式一般概括美国专利第8,022,046、7,964,574、8,389,493和7,884,085号以及美国申请第12/822,774号通过引用的方式纳入。本说明书中提到的所有出版物和专利申请均通过引用的方式纳入本文，程度如同每个单独出版物或专本文档来自技高网...

【技术保护点】
致耐受性树突细胞用于使幼年哺乳动物中的血糖恢复到糖尿病前水平的用途，其包括：在所述幼年哺乳动物中接近胰脏的一个或多个注射部位给予所述致耐受性树突细胞的两次或更多次皮下注射，其中所述血糖恢复到所述糖尿病前水平并持续至少二十四小时。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.18 US 61/905,7871.致耐受性树突细胞用于使幼年哺乳动物中的血糖恢复到糖尿病前水平的用途，其包括：在所述幼年哺乳动物中接近胰脏的一个或多个注射部位给予所述致耐受性树突细胞的两次或更多次皮下注射，其中所述血糖恢复到所述糖尿病前水平并持续至少二十四小时。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述致耐受性树突细胞分离自所述幼年哺乳动物或者相同物种的不同哺乳动物。3.根据权利要求1至2中任一项所述的用途，其中所述致耐受性树突细胞是已预先冷冻的。4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述一个或多个注射部位中的一个为所述胰脏左侧约3.25至约2.25英寸并且在所述胰脏上方约2至约1英寸。5.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述一个或多个注射部位中的一个为所述胰脏左侧约1.75至约0.75英寸并且在所述胰脏上方约2至约1英寸。6.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述一个或多个注射部位中的一个为所述胰脏左侧约3.25至约2.25英寸并且在所述胰脏上方约3至约2英寸。7.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述一个或多个注射部位中的一个为所述胰脏左侧约1.75至约0.75英寸并且在所述胰脏上方约3至约2英寸。8.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述给药包括至少4个注射部位。9.根据权利要求8所述的用途，其中所述第一注射部位为所述胰脏左侧约3.25至约2.25英寸并且在所述胰脏上方约2至约1英寸，其中所述第二注射部位为所述胰脏左侧约1.75至约0.75英寸并且在所述胰脏上方约2至约1英寸，其中所述第三注射部位为所述胰脏左侧约3.25至约2.25英寸并且在所述胰脏上方约3至约2英寸，并且其中所述第四注射部位为所述胰脏左侧约1.75至约0.75英寸并且在所述胰脏上方约3至约2英寸。10.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其还包括给予所述致耐受性树突细胞的至少3、4或5次皮下注射。11.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述血糖水平恢复到所述糖尿病前水平并持续约25至约35天。12.根据权利要求1至10中任一项所述的用途，其中所述血糖水平恢复到所述糖尿病前水平并持续约65至约75周。13.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述幼年哺乳动物是人。14.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述给药不包括给予额外的免疫抑制治疗。15.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述给药防止在距所述注射部位3个细胞长度的径向距离内T细胞的共刺激。16.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中用至少一种标记物标记所述致耐受性树突细胞。17.根据权利要求16所述的用途，其中所述标记物是荧光标记物。18.根据权利要求17所述的用途，其中所述荧光标记物是活力指示剂。19.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中并非全部所述致耐受性树突细胞都用标记物标记。20.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述致耐受性树突细胞的两次或更多次皮下注射包含至少一个颗粒，其中所述颗粒含有包括SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7中给出的核酸序列或其组合的寡核苷酸。21.根据权利要求20所述的用途，其中用至少一种标记物标记所述所述颗粒。22.根据权利要求20所述的用途，其中并非全部所述颗粒都用标记物标记。23.根据权利要求21至22中任一项所述的用途，其中所述标记物是荧光标记物。24.根据权利要求23所述的用途，其中所述荧光标记物是pH指示剂。25.根据权利要求16所述的用途，其还包括在给予所述致耐受性树突细胞后追踪所述标记物。26.根据权利要求16所述的用途，其还包括对所述至少一种标记物在预定解剖学位置处的积累的定量。27.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述幼年哺乳动物的1型糖尿病临床发病至少1个月。28.根据权利要求1至26中任一项所述的用途，其中所述幼年哺乳动物的1型糖尿病临床发病至少1年。29.根据权利要求1至26中任一项所述的用途，其中所述幼年哺乳动物的1型糖尿病临床发病至少5年。30.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述幼年哺乳动物是人。31.根据权利要求1至29中任一项所述的用途，其中所述幼年哺乳动物是小鼠或非人灵长类动物。32.根据权利要求30所述的用途，其中所述人为约1至约5岁，约6至约10岁，或者约11至约18岁。33.根据权利要求30所述的用途，其中所述人患有幼年发病的糖尿病。34.根据权利要求1所述的用途，其还包括：扩增所述幼年哺乳动物中的抑制性B细胞群，其中与全身抑制性B细胞扩增相比，在所述胰脏附近发生抑制性B细胞群的更高局部扩增。35.根据权利要求34所述的用途，其中不给予额外的免疫抑制治疗。36.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·吉安诺卡吉斯，M·M·特鲁科，
申请(专利权)人：高等教育联邦系统匹兹堡大学，
类型：发明
国别省市：美国;US